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表观遗传研究

发布日期:2013/9/12 14:28:57      

研究目的

        DNA甲基化是表观遗传学研究的重点,是基因调控的手段之一,在维持细胞正常功能、传递基因组印记、胚胎发育和肿瘤发生等方面起着至关重要的作用。基于不同的新一代测序研究方案,检测表观遗传学变异尤其是基因组的甲基化,探讨甲基化对于生物学功能的影响,并筛选可应用作为疾病早期诊断、分级和分型的分子标记。


研究对象和取材

        研究对象:各类肿瘤、发育、干细胞分化的不同阶段。

        取样标准:肿瘤组织与正常组织有明显区别,组织病理切片分析肿瘤样品中肿瘤细胞的比例在80%以上;正常样品中几乎不含有肿瘤细胞,或以血液作为正常对照。


新一代测序方案

        RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing)基于MspⅠ酶切消化和bisulfite处理的高性价比方法,可对基因组promoter区及CpG岛区域的DNA甲基化状态进行样品之间的比较分析。

        MBD-Seq(Methylated DNA Binding Domain Sequencing)由于在哺乳动物中甲基化一般发生在CpG的胞嘧啶5位碳原子上,所以可通过特异性结合甲基化DNA的蛋白MBD2b富集高甲基化的DNA片段,并结合第二代高通量测序,对富集到的DNA片段进行测序,从而检测全基因组范围内的甲基化位点。

        MeDIP-Seq(Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing )通过使用5' -甲基胞嘧啶抗体富集高甲基化的DNA片段,然后将富集后的DNA进行高通量测序。

        BS(Bisulfite Sequsencing)Bisulfite处理能够将基因组中未甲基化的C碱基与甲基化的C碱基区分开来,因此成为表观遗传学研究的经典实验方法。将Bisulfite处理与高通量测序技术的结合的Bisulfite Sequencing能够绘制单碱基分辨率的DNA甲基化图谱,可用于研究特定DNA区域甲基化与特定表型之间的关联。


案例解读

案例(一)RRBS作为一种高性价比的甲基化研究方法,在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景

        RRBS是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法,通过酶切富集启动子及CpG岛区域,并进行Bisulfite测序,同时实现DNA甲基化状态检测的高分辨率和测序数据的高利用率。研究者进行了全基因组甲基化测序(BS)和RRBS的比较,发现RRBS在启动子,CpG岛区域具有更高的覆盖倍数,并且RRBS和BS具有很好的相关性。RRBS可作为一种更高效经济的研究方法,在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。

图1. RRBS和BS在CpG岛平均覆盖深度的比较,其中RRBS的测序数据为6G,BS的测序数据是103.5G



图2. RRBS和BS甲基化水平的相关性分析

案例(二)运用ERRBS甲基化测序研究前列腺癌

        研究者通过Enhanced Reduced Representation BisulfiteSequencing(ERRBS)对7个局限性前列腺癌(PCa)组织样本,7个对应的良性前列腺(Ben)组织样本,6个去势抵抗前列腺癌(CRPC)组织样本进行了高通量测序。通过对三组样本的分析,发现甲基化程度随着疾病严重程度的增加而增加,进一步的研究发现大部分的PCa甲基化改变发生在等位基因特异甲基化区域。


图3. DNA甲基化程度随疾病严重程度增加而增加  A.三组样本 CpG岛和非CpG岛区域的DNA甲基化程度
B.韦恩图显示从Ben到PCa和从PCa到CRPC的甲基化程度增加的CpG岛区域的交集

案例(三)运用MBD-seq找到神经母细胞瘤预后甲基化生物标志

        研究者通过methyl-CpG-binding domain (MBD-seq)方法,对8个神经母细胞瘤细胞系进行了高通量测序。通过高通量测序,初步筛查到了43个候选的生物标志。后期研究者又通过在89个初级神经母细胞瘤肿瘤样本中进行进一步的PCR验证,最后筛查出了HIST1H3C 和GNAS的甲基化水平和总生存率以及无事件存活率相关。

图4. HIST1H3C 和GNAS的甲基化水平和总生存率以及无事件存活率的相关性分析。U代表未甲基化的病例,M代表甲基化的病例



案例(四)通过MeDIP-seq找到了急性髓细胞白血病特有的甲基化区域

        研究者通过对12个急性髓细胞白血病(AML)病人和4个正常人的骨髓进行了MeDIP-seq。通过聚类分析,找到了AML的特有的甲基化区域。进一步的研究发现,SPHKAP, DPP6, ID4这三个基因在AML中表达量很低,用去甲基化的药物处理后,这些基因的表达量都有不同程度的升高。

图5. SPHKAP, DPP6 和ID4 在AML中的表达量。(A.1, B.1, C.1) 分别代表SPHKAP, DPP6, ID4 在AML和正常组织中的
表达水平(A.2,B.2, C.2)分别代表SPHKAP, DPP6, ID4在 OCI-AML2和CTS细胞系用DAC处理前后的表达水平。

参考文献

1. Wang L, Sun J, Wu H, et al. Systematic assessment of reduced representation bisulfite sequencing to human blood samples: A promising method for large- sample-scale epigenomic studies. J Biotechnol. 2012; 157(1): 1- 6.

2. Lin PC, Giannopoulou EG, Park K, et al. Epigenomic alterations in localized and advanced prostate cancer. Neoplasia. 2013; 15(4):373- 83.

3. Decock A, Ongenaert M, Hoebeeck J, et al. Genome-wide promoter methylation analysis in neuroblastoma iden tifies prognostic methylation biomarkers. Genome Biol. 2012; 13(10): R95.

4. Saied MH, Marzec J, Khalid S, et al. Genome wide analysis of acute myeloid leukemia reveal leukemia specific methylome and subtype specific hypomethylation of repeats. PLoS One. 2012; 7(3): e33213.

G0012 锐博生物——基于新一代测序的表观遗传学研究.pdf




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