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TCR多样性测序

发布日期:2013/9/13 9:12:10      

研究背景

        T细胞受体(T cell receptor,TCR)是T细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的分子,是人类基因组中多态性最高的区域之一,决定着人的免疫系统如何适应环境的变化。T细胞受体库的多样性(包括基因重组以及选择性表达)直接反映了机体免疫应答的状态。TCR可分为TCRα/β和TCRγ/δ两种类型, 外周血T细胞主要为TCRα/β的T细胞, 是介导机体特异性细胞免疫反应的主要细胞。如图1所示:TCRβ基因由可变区(V)、多变区(D)、结合区(J)和恒定区(C)四部分基因片段组成,形成互补决定区(complementarities determining region, CDR)和间隔的4个骨架区(framework region, FR),如图所示。在T细胞发育过程中CDR1,2和FR区域相对保守,CDR3区由V、 D和J 进行重排而形成具有功能的TCR编码基因(T细胞克隆),由于V (65-100种)、D (2种)、J (13种)基因片段本身具有多样性,此外,由于在重排的过程中,在VD及D-J的连接区经常有非模板的核苷酸的随机插入或删除,进一步增加了CDR3区的多样性(连接形成的多样性约为2 × 1011)。这种基因片段连接的不准确性使TCR的表达呈多样性, 以识别各种不同的抗原。正常个体在无抗原刺激时,TCR基因重排是随机的,因此正常人外周T细胞呈多家族、多克隆性特点。不同抗原(肿瘤、疫苗、病院微生物或者移植物等)刺激后,TCR基因可对该抗原产生特异性识别,并使带有这类基因的T细胞得到优势扩增,可用于分析不同 TCR V亚家族T细胞的表达和利用。


图1. TCR重组过程及TCR结构示意图



研究对象:肿瘤免疫、自身免疫性疾病、移植免疫监测、疫苗注射免疫监测。

取材:富含T淋巴细胞或B淋巴细胞的血液或组织液,分离的淋巴细胞> 1x104


测序流程:

        图2所示,从不同来源的物种分离获得T/B细胞,富集TCR序列,进行高通量测序,结合生物信息学分析获得TCR重组的信息。图3展示了TCR序列富集的方法。


图2. 测序流程图


图3.TCR的富集 A. 在V基因上设计多个上游引物,在J基因上设计多个下游引物,
直接进行多重扩增获取TCR的序列 B. 通过5’RACE获得TCR


案例解读:

目的:干细胞移植(HSCT)后,利用新一代测序技术对TCR(T细胞受体)的CDR3(VDJ基因重组区域)区域进行重组分析获得移植后病人的CD4+和CD8+T细胞的多样性,从而检测移植受体免疫重建的结果。通过比较不同来源的干细胞(造血干细胞、去除T细胞的造血干细胞、脐血干细胞)移植后的TCR的多样性进行移植效果的判断,并阐述TCR多样性与细菌感染的关系。

方法:选取干细胞移植的病人作为研究对象,时间点为移植后6个月和12个月,以健康人作为对照。从8ml外周血中分理CD4+和CD8+ T细胞处利用高通量测序技术结合生物信息学分析检测TCR的CDR3区域重组的多样性。

结果:1.对去除T细胞(TCD)的干细胞移植病人的测序结果分析发现移植病人的TCR的多样性比健康人要低。如图4所示。


图4. A.TCD病人和健康人对比,TCR重组过程中V基因家族使用的频率。B.CDR3区域的长度分布。
C.D.E.TCD病人比健康人的T细胞克隆数要少,且多样性低100倍。

2. 对不同来源的干细胞进行TCR多样性分析,发现脐血干细胞移植后,TCR的多样性最高,且CD4+来源的TCR比CD8+来源的TCR多样性高。如图5所示。

 图5. A.传统干细胞移植 B.去除T细胞的造血干细胞移植 C.脐血干细胞移植以6个月和12个月后
CD4+和CD8+ 的TCR多样性统计。


3.年龄和供体对干细胞移植后TCR的多样性影响不大,但是出现急性移植物抗宿主病及全身类固醇治疗的病人有着较高的TCR多样性,相反,出现巨细胞病毒(CMV)疱疹病毒(EBV)感染的病人TCR多样性比较低。如图6所示。

 

图6. A. 不同年龄的病人造血干细胞移植后的TCR多样性统计 B. 不同供体的TCR多样性统计 C. 出现移植物抗
宿主病(GVHD)的病人 D. 全身类固醇治疗 E.巨细胞病毒(CMV)疱疹病毒(EBV)感染的病人TCR多样性。


参考文献

1. Van Heijst JW, Ceberio I, Lipuma LB, et al. Quantitativeassessment of T cell repertoire recovery after hematopoietic stem cell nsplantation.Nat Med. 2013; 19(3): 372- 7.

2. Benichou J, Ben- Hamo R, Louzoun Y, Efroni S. Rep- Seq: uncovering the immunological repertoire through next- generation sequencing.Immunology. 2012; 135(3): 183- 91.

G001 锐博生物——基于新一代测序的免疫组学研究.pdf

 




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