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Nature子刊丨锐博circRNA测序/动物用miRNA产品助力CircAnks1a调控神经性疼痛新机制发现

许多信号级联和分子(如神经炎症反应、嘌呤受体、内源性阿片肽和神经营养因子)参与神经性疼痛的发展。然而,神经性疼痛的分子机制尚不清楚。环状RNAs(circRNAs)是内源性非编码RNA,形成共价闭环;它们的序列在物种间是保守的,比线性mRNAs具有更高的稳定性。大多数circRNAs在哺乳动物大脑中的表达丰度高于其他组织,这表明它们可能在病理过程中发挥重要作用,并可能作为某些神经系统疾病的生物标志物。CircRNAs已被证明可作为竞争性内源RNAs,通过碱基互补配对使miRNAs结合并调节靶mRNAs的翻译。此外,有证据表明某些circRNAs可与RNA结合蛋白形成RNA-蛋白复合物并调节其活性。虽然最近的研究表明,神经损伤改变了大鼠脊髓背角circRNA的表达,但circRNA是否以及如何引起神经性疼痛尚未见报道。

2019年9月11日,中山大学中山医学院信文君课题组在Nature Communications期刊上发表了题为CircAnks1a in the spinal cord regulates hypersensitivity in a rodent model of neuropathic pain最新成果。首次发现脊髓特异性环状RNA circAnks1a促进转录因子YBX1的核转位,揭示了circAnks1a在转录水平和转录后水平调控背角神经元VEGFB表达,并参与神经损伤引起的中枢敏化和疼痛行为的分子机制,为开发有效治疗神经损伤引起的神经性疼痛提供了新的靶点。

1、脊髓背角circAnks1a的筛选与鉴定

首先,研究人员收集了脊神经结扎(SNL)前后大鼠的脊髓背角组织并通过RNA-seq(由锐博生物提供)检测其circRNA的表达。发现65.02%的circRNAs由编码蛋白质的外显子组成,并且发现SNL处理后有21个circRNAs显著失调。通过qPCR分析发现circAnks1a表达在SNL处理后表现出最显著的增加。

随后,研究人员通过计算机分析预测和Sanger测序证实了circAnks1a来源于Anks1a基因的5-11外显子,并通过一系列实验验证了circAnks1a环化的特异性及其稳定性。此外,研究人员发现circAnks1a主要在正常大鼠脊髓背角中表达,SNL处理仅显著增加了circAnks1a在脊髓背角的表达,表明circAnks1a是脊髓/疼痛特异性(组织/状态特异性)表达的环状RNA。FISH和qPCR检测进一步证实circAnks1a在背角神经元的细胞核和细胞质中表达。

2、增加circAnks1a可介导疼痛样超敏反应

为了验证circAnks1a与慢性疼痛有关,研究人员通过鞘内注射的方式将circAnks1a siRNA注射到SNL处理的大鼠体内。电生理和疼痛行为分析发现敲低CircAnks1a可显著改善SNL诱导的mEPSCs振幅和频率的增加,并可减弱SNL诱导的机械性异常性疼痛。过表达CircAnks1a则产生相反的结果。表明脊髓特异性和保守性circAnks1a有助于中枢致敏和行为超敏反应,可能是治疗慢性疼痛的新靶点。

3、VEGFB促进神经元兴奋和神经性疼痛

为了阐明circAnks1a调控神经性疼痛的分子机制,研究人员将circAnks1a的AAV过表达载体注射到大鼠体内,并通过全基因组表达谱芯片分析脊髓背角基因表达的变化。结果发现有29个转录本表达上调,其中VEGFB mRNA的表达表现出最大的增加,并且VEGFB mRNA和蛋白水平在SNL模型中也是显著增加。此外,VEGFB仅在神经元(NeuN)中表达,而在脊髓背角星形胶质细胞(GFAP)或小胶质细胞(Iba-1)中不表达。通过鞘内注射VEGFB siRNA可显著改善mEPSC振幅和频率的增加,并减轻了SNL诱导的机械性异位性疼痛。过表达VEGFB则产生相反的结果。表明VEGFB在神经损伤引起的神经性疼痛的发生过程中起着重要的作用。

4、CircAnks1a调节VEGFB在神经病理性疼痛中的上调

研究人员进一步研究了在SNL诱导的慢性疼痛中,VEGFB的上调是否由circAnks1a介导。结果显示circAnks1a与VEGFB共定位,鞘内注射circAnks1a siRNA可减少SNL后脊髓背角中VEGFB mRNA和蛋白的上调。过表达circAnks1a则显著增加VEGFB mRNA和蛋白质水平。表明SNL处理后脊髓背角中VEGFB的上调依赖于circAnks1a的表达。

5、CircAnks1a促进YBX1的核转位

为了阐明circAnks1a调节VEGFB表达的分子机制,研究人员通过RNA pulldown、RIP等实验证实了circAnks1a与YBX1蛋白之间存在明显的相互作用,并且在细胞质和细胞核中均有结合。此外,还发现SNL处理后,细胞核YBX1的数量显著增加,且这一增长与circAnks1a的增长呈现出类似的时间过程。那么circAnks1a是否参与了YBX1的核转位呢?结果发现敲低circAnks1a抑制了核YBX1的积累,过表达circAnks1a则显著增加了核YBX1的水平。进一步的实验发现transportin-1能够与YBX1相互作用,并介导YBX1的入核。而鞘内注射circAnks1a siRNA可显著减弱这种相互作用。表明circAnks1a通过直接与YBX1相互作用,增强了YBX1与transportin-1的相互作用,从而促进了神经损伤后YBX1在背角的核转位。

6、YBX1促进VEGFB上调

为了证明YBX1是否参与了circAnks1a介导的VEGFB上调,研究人员通过免疫荧光实验发现YBX1免疫荧光与VEGFB阳性细胞共定位。此外,注射YBX1 siRNA完全抑制了SNL大鼠VEGFB mRNA的上调,部分抑制了其蛋白的增加。值得注意的是,注射transportin-1 siRNA还减弱了细胞核中YBX1的上调以及VEGFB mRNA和蛋白质的增加。

7、CircAnks1a促进YBX1向Vegfb启动子的募集

为了探索核YBX1介导VEGFB上调的机制,研究人员首先预测了Vegfb基因启动子区域中YBX1的潜在结合位点。ChIP-PCR分析显示SNL处理后YBX1向Vegfb启动子的募集显著增加。随后的荧光素酶报告基因实验也证实了YBX1与Vegfb启动子的结合是功能性的,过表达YBX1可增强荧光素酶活性。

进一步的实验发现:抑制circAnks1a的表达显著降低了YBX1的富集,过表达circAnks1a则增加了YbX1在Vegfb启动子上的富集。荧光素酶分析也显示过表达circAnks1a可增强YBX1与Vegfb启动子的结合,表明circAnks1a可能直接促进YBX1向Vegfb启动子的募集。接下来的ChIRP和荧光素酶分析显示circAnks1a是与Vegfb启动子的-1834到-1687(promoter region 1)位置强烈结合。表明细胞核外显子circAnks1a直接与Vegfb基因结合,并通过募集YBX1到Vegfb启动子来促进Vegfb的转录。

8、CircAnks1a通过miR-324-3p调控VEGFB的表达

研究人员通过RIP和qPCR分析发现circAnks1a可能具有吸附miRNA的能力。随后,通过miRanda预测、荧光素酶报告基因实验、RNA pull-down等确定了miR-324-3p,并且FISH实验发现miR-324-3p在神经元中表达,与circAnks1a共定位。表明circAnks1a作为miR-324-3p的海绵。

接下来,研究人员还发现miR-324-3p与VEGFB共定位,并且miR-324-3p可与VEGFB mRNA的3’UTR结合。体内实验显示鞘内注射miR-324-3p agomir(由锐博生物提供)可显著降低VEGFB蛋白的增加,但不影响VEGFB mRNA水平,此外还可显著增加机械性痛觉超敏和热痛觉过敏。鞘内注射miR-324-3p antagomir(由锐博生物提供)则产生相反的结果,表明CircAnks1a是通过miR-324-3p调控VEGFB的表达。

原文:Zhang S B, Lin S Y, Liu M, et al. CircAnks1a in the spinal cord regulates hypersensitivity in a rodent model of neuropathic pain[J]. Nature communications, 2019, 10(1): 1-16.

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