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重磅丨锐博外泌体miRNA-seq和Agomir助力心脏保护运动因子发现

运动训练除了降低心血管危险因素外,可直接预防心肌缺血/再灌注(MI/R)损伤,还与提高人类心脏病发作存活率有关。然而,运动所提供的心脏保护的潜在机制仍不清楚。研究表明运动诱导的循环外泌体可能对心血管具有重要益处,为了揭示运动衍生的循环外泌体在心脏保护中的作用及其分子机制,第四军医大学高峰、王立峰课题组在Circulation Research(影响因子:15.211)上发表了题为Longterm Exercise-Derived Exosomal miR-342-5p的重要成果。该研究揭示了一种新的内源性心脏保护机制:长期运动衍生的循环外泌体通过外泌体miR-342-5p保护心脏免受心肌缺血/再灌注损伤

研究结果

1、四周游泳训练保护大鼠心脏免受MI/R损伤

研究人员对一组大鼠进行游泳训练,每天2次,持续进行4周。在最后一次训练24小时后,大鼠心肌缺血30分钟后再灌注24小时。发现与对照组相比,运动组大鼠表现出心肌梗死面积的减小和血清乳酸脱氢酶(LDH)水平的降低(乳酸脱氢酶主要存在于心肌细胞中,乳酸脱氢酶水平偏高,可以作为心肌受损的指标),表明4周的运动训练可提供防止MI/R损伤的心肌保护。

2、长期运动的大鼠和人类血浆外泌体的表征和体外功能验证

最后一次训练24小时后,分离运动大鼠(Exe-exo)和久坐大鼠(Sed-exo)血浆中的外泌体。电镜分析显示直径为30-100nm的典型圆形颗粒,Western blot证实外泌体标记蛋白(TSG101和CD81)的存在,并显示Sed-exo和Exe-exo之间没有显著的差异。然后将这两种外泌体分别与受损的心肌细胞共孵育,发现Exe-exo预孵育48小时后,H/R诱导的心肌细胞损伤减弱,如心肌细胞凋亡和LDH释放减少,而Sed-exo却没有这种效果。

然后研究人员检查了运动对人体循环外泌体的影响。招募了16名健康男学生运动员,让他们进行1年以上的赛艇训练(每天训练1-2小时,每周6天);同时招募16名未经训练的男性对照学生。最后一次训练课程24小时后采集血样,收集赛艇运动员(Row-exo)或对照学生(Con-exo)血浆中的外泌体。同样地,发现Row-exo预孵育减少了心肌细胞凋亡和LDH释放并增加了心肌细胞活力。这些结果表明:运动衍生的血浆外泌体对H/R诱导的心肌细胞损伤发挥保护作用

3、心肌内递送运动衍生的循环外泌体可减少MI/R后的梗死面积并改善心功能

为了确定体内Exe-exo的心脏保护作用,将Exe-exo或 Sed-exo通过心肌内注射到大鼠中,48h后再进行MI/R。与对照大鼠相比,Exe-exo处理的大鼠表现出梗死面积的显著减小,并伴随着血清LDH的降低和心脏功能的改善。体内实验表明了Exe-exo对MI/R损伤具有心脏保护作用。

4、miR-342-5p是Exe-exo诱导的心脏保护作用的关键组分

为了探讨miRNA(s)是否参与了Exe-exo诱导的心脏保护作用,研究人员通过miRNA-seq(外泌体miRNA建库、miRNA-seq服务由锐博生物提供) 和qRT-PCR验证在Exe-exo和Sed-exo中鉴定了12个差异表达的miRNAs。其中miR-342-5p是最有效的心脏保护分子,可显著降低H/R作用下心肌细胞的凋亡,降低LDH的释放,并增加细胞活力。并且发现学生运动员体内的外泌体miR-342-5p水平比未经训练的对照组学生更高。

为了更好地理解外泌体miR-342-5p的功能,研究人员检测了miR-342-5p及其前体在血浆外泌体处理的心肌细胞和心脏中的表达水平。发现miR-342-5p水平在Exe-exo处理的心肌细胞和心脏中显著升高,而pre-miR-342-5p水平没有显着变化,表明Exe-exo是将miR-342-5p递送至心肌细胞或心脏。此外,miR-342-5p的抑制显著减弱了运动衍生的血浆外泌体的保护作用。表明miR-342-5p在Exe-exo诱导的心脏保护中发挥了关键作用。

5、miR-342-5p通过靶向心肌细胞中的Caspase 9和Jnk2发挥抗凋亡作用

研究人员通过数据库预测了miR-342-5p可能的靶基因,最后重点关注参与缺血/再灌注损伤和凋亡途径的Caspase 3、Caspase 9 和Jnk2。研究发现miR-342-5p mimic/inhibitor可显著减低/增加心肌细胞中Caspase 9和Jnk2蛋白水平,Caspase 3的表达则无显著变化。萤光素酶报告基因实验进一步验证了Caspase 9和Jnk2的3’UTR中miR-342-5p的结合位点。此外,miR-342-5p mimic与心肌细胞预孵育显著抑制了H/R诱导的裂解的Caspase 3、裂解的Caspase 9和磷酸化(p-Jnk2 (Thr183/Tyr185)的增加。这些结果表明miR-342-5p通过靶向心肌细胞中的Caspase9和Jnk2发挥抗细胞凋亡作用。

6、miR-342-5p通过靶向Ppm1f增强心肌细胞Akt的磷酸化

生存信号Akt和Erk1/2作为心脏保护的关键分子已被广泛报道。miR-342-5p mimic/inhibitor可提高/降低心肌细胞中Akt的磷酸化水平,而Erk1/2的磷酸化没有显著变化。在H/R处理的心肌细胞中也观察到类似的结果。表明miR-342-5p可以激活心肌细胞中的促存活信号Akt。此外,研究人员发现Ppm1f是miR-342-5p潜在靶点中唯一的磷酸酶。miR-342-5p mimic/inhibitor可降低/增加心肌细胞中Ppm1f蛋白水平。萤光素酶报告基因实验进一步证实了miR-342-5p直接靶向Ppm1f 3’UTR。值得注意的是,通过siRNA沉默下调Ppm1f蛋白表达不仅显著提高了Akt磷酸化水平,而且还降低了由H/R诱导的心肌细胞凋亡,表明Akt磷酸化水平升高可能在miR-342-5p提供的心脏保护中发挥作用。

7、内皮细胞是运动诱导的外泌体miR-342-5p的主要来源

为了探索长期运动导致循环外泌体miR-342-5p增加的来源,研究人员检测了miR-342-5p在大鼠不同部位中的表达。发现成熟miR-342-5p在多个组织中表达。经过4周游泳训练,这些组织中miR-342-5p表达显著升高,而这是由主动脉所导致的。进一步研究表明,主动脉内皮的去除显著降低了运动大鼠主动脉中miR-342-5p水平,提示内皮细胞是主动脉中miR-342-5p的主要来源。研究发现长期运动也显著增加了内皮细胞中miR-342-5p表达。此外,电镜鉴定了内皮细胞胞浆中存在典型的多泡体(MVBs),MVBs与质膜融合可释放腔内外泌体进入循环。表明血管内皮细胞是运动诱导循环外体miR-342-5p升高的重要来源。

接下来,为了研究内皮细胞释放的外泌体是否能被心肌细胞摄取。研究人员从转染了Cy3标记的miRNA的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)条件培养基中分离出外泌体,然后加入到培养的人心肌细胞中。共聚焦成像证实了外泌体Cy3标记的miRNA从内皮细胞向心肌细胞的转运,miR-342-5p在受体心肌细胞中的表达增加。更重要的是,受体心肌细胞在H/R后凋亡减少。这些结果表明内皮细胞释放含有miR-342-5p的外泌体不仅能被心肌细胞所吸收,还能保护心肌细胞免受H/R损伤。

8、miR-342-5p在体内长期运动诱导的心脏保护中必不可少

为了探讨miR-342-5p在体内运动诱导的心脏保护中的作用,研究人员在大鼠游泳训练前一周通过心肌内注射AAV-anti-miR-342-5p或aav-阴性对照。发现运动训练可增加心脏miR-342-5p,同时降低心肌Caspase 9、Jnk2和Ppm1f的表达,并且增加Akt磷酸化;AAV-anti-miR-342-5p处理可减弱这些变化。重要的是,在运动的MI/R大鼠中观察到心肌梗塞面积和心肌细胞凋亡减少,这通过AAV-抗-miR-342-5p处理可显著减弱这些变化。此外,在MI/R前48小时,miR-342-5p agomir(由锐博生物提供)治疗显著提高了大鼠心脏的miR-342-5p水平,并减少了心肌梗死面积。这些体内数据表明miR-342-5p在长期运动诱导的心肌保护中对MI/R损伤具有重要作用。

原文:Hou Z, Qin X, Hu Y, et al. Longterm Exercise-Derived Exosomal miR-342-5p: A Novel Exerkine for Cardioprotection[J]. Circulation research, 2019.

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