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如何研究tRFs?不妨先看这篇Cell Research文章!

最近,小编收到很多小伙伴在锐博生物在线平台(www.ribobio.com)咨询tRFs相关的研究工具或思路,然后小编搜索关键词“tRNA-Derived Fragments”,发现近几年tRFs发表文章的数量,情况是这样的:

而近三年tRFs/tRNA来源的小RNA相关的国自然项目也不少!

tRFs(tRNA-Derived Fragments)是一类长度<40nt,来源于tRNA转录本的非编码小片段RNA。最近的研究表明,这些小RNA片段具有特定的生物学功能,如抑制基因表达、调节细胞凋亡和跨代表观遗传。通过对小RNA片段进行高通量测序和分析可鉴定tRFs,并且它们可对应到已知的tRNA基因。根据tRFs在初级或成熟tRNA转录本上的映射位置,可将其分为不同的类型:

  •       tiRNA (tiR)或tRNA halves:由应激(和饥饿)诱导的tRNA片段,通过在成熟tRNAs的反密码子环中特异性切割而产生,长约31-40个        碱基,在非应激条件下也可检测到。根据它们是否包含反密码子切割位点的5’或3’序列,tiR有两个亚类5tiR从成熟tRNA的5’末端          开始并在反密码子环中终止,而3tiR从反密码子环开始并在成熟tRNA的3’末端终止。

  •       另一类tRNA衍生的小RNAs长约14-30nt,这些小RNAs与miRNAs类似,具有5’磷酸和3’羟基,并且由于其与miRNA的大小相似而          受到广泛关注。根据其映射位置,这些tRFs可分为三种类型:tRF-5、tRF-3和tRF-1。tRF-5和tRF-3分别从成熟tRNAs的5’和3’末端         产生,而tRF-1从初级tRNA转录本的3’末端产生。

tRFs在病毒(疱疹病毒和HIV-1)、古生菌(Haloferax volcanii)、细菌、原生动物(四膜虫)、植物(大麦和水稻胚性愈伤组织)、鸡、小鼠和人类中均有报道。因此,这类小RNAs跨越了整个进化树,并且已经确定了生物亚群中某些tRFs的生物学作用。

已知文献报道的tRFs的生物学功能

下面小编整理了一篇今年发表在Cell Research上的文章,研究思路也是很经典的从tRF的鉴定、功能研究、作用机制研究以及到临床研究,其中涉及的研究工具和方法值得各位小伙伴们借鉴,一起来看看吧!

研究背景

tRNAs衍生的小RNA已经在各个研究领域得到了广泛的研究。多项证据表明,tRNA衍生片段(tRFs)是参与包括基因表达调控在内的各种生物学过程的功能分子,并且tRFs可以抑制蛋白质合成。Gebetsberger等人发现tRFs通过与mRNA竞争核糖体结合来调节应激时的翻译。另外,成熟tRNAs特异性切割所产生的tRFs是由氧化应激、热/冷休克、紫外线照射等多种应激源诱导的,而tRNAs的内源性核苷酸裂解是真核生物中一种广泛保守的氧化应激反应。此外,血管生成素(angiogenin, ANG)是一种应激激活的核糖核酸酶,参与tRF的生物发生。酒精的摄入促进肝脏中ROS的产生,主要是过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子(O2−),而氧化应激在AFLD的发病机制中起着重要的作用。虽然tRFs的功能已被广泛研究,但其在AFLD中的作用和分子机制尚不清楚。

广西医科大学第一附属医院何松青教授课题组在Cell Research期刊上发表了题为Complement C3 activation regulates the production of tRNA derived fragments Gly-tRFs and promotes alcohol-induced liver injury and steatosis的研究论文,阐明了C3活化产物通过调节Gly-tRF的表达促进肝脂肪变性的分子机制,揭示补体在C3活化阶段的抑制和Gly-tRF inhibitors的治疗可能是AFLD潜在的和精准的治疗方法。

研究结果

1、靶向补体抑制剂CR2-Crry或C3缺陷对酒精诱导的肝脂肪变性和肝损伤的治疗效果

研究表明,C3活化与AFLD的发展有关,那么CR2-Crry作为一种补体C3活化的特异性抑制剂对酒精诱导的肝脂肪变性和炎症具有怎样的治疗效果呢?研究发现野生型(WT)小鼠在喂养酒精后血清C3a水平升高,而C3-/-小鼠或CR2-Crry处理则可降低C3a水平,减少C3d的积累,显著降低酒精诱导的肝脂肪变性。此外,CR2-Crry处理和C3缺陷可显著降低酒精诱导的小鼠丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平的升高,并且对酒精诱导的炎症具有保护作用。进一步的实验还证明了CR2-Crry治疗可预防AFLD小鼠肝脏缺血再灌注损伤(IRI)。

2、补体C3调节CYP2E1的表达

氧化应激是导致AFLD发病的主要因素,CYP2E1作为细胞色素P450混合功能氧化酶系统成员,其表达和活性在酒精喂养的WT小鼠中增加,但在C3−/−或CR2-Crry治疗小鼠中则降低。而通过C3a或其降解产物C3a-des-arg(Asp)可恢复C3−/−小鼠中CYP2E1表达的降低,再次表明CYP2E1表达与C3活化有关。

3、C3调节Gly-tRF表达导致AFLD小鼠脂肪变性(Gly-tRF的鉴定与功能研究)

氧化应激在AFLD的发展中起着重要作用,而tRNA裂解在氧化应激反应中是保守的,因此研究人员推测tRNA衍生片段(tRFs)是AFLD发展的重要因子。通过对短期酒精喂养小鼠肝组织进行小RNA高通量测序发现酒精喂养小鼠肝脏中的Gly-tRFs表达上调。

随后,为了研究Gly-tRF在AFLD中的作用,研究人员在AFLD小鼠模型中使用inhibitors来抑制Gly-tRF在体内的表达。发现Gly-tRF inhibitors(由锐博生物定制合成【RiboBio】)治疗的小鼠血清ALT和AST水平显著降低,并且可显著降低酒精诱发的微泡和大泡性肝脂肪变性,但促炎细胞因子TNF-α和IL-6不受其影响。另外,Gly-tRF在C3-/-小鼠或CR2-Crry治疗小鼠中的表达显著降低,但通过C3a或Asp又可恢复其表达。此外,下调CYP2E1可降低AFLD小鼠肝脏Gly-tRF的表达。C5缺陷则对Gly-tRF表达及肝脂肪变性无影响。

4、Gly-tRF参与AFLD小鼠脂质代谢途径的调控(作用机制与临床研究)

接下来,研究人员在AFLD小鼠模型中研究了与Gly-tRFs相关的分子机制。通过对Gly-tRF inhibitors治疗小鼠的肝组织进行转录组测序发现Gly-tRF与AFLD小鼠的脂质代谢有关,Gly-tRF inhibitors下调了Srebp-1c、Fasn、Lipin1、Acc等脂肪酸合成相关基因的表达,上调了PparaCpt1a等β-氧化相关基因的表达。此外,转录组分析表明Gly-tRF inhibitors可上调Sirt1的表达。过表达Sirt1可以减轻AFLD小鼠的肝脂肪变性,且下调了CYP2E1、ANG和Gly-tRF的表达。进一步的实验证明了Gly-tRF是通过靶向AFLD小鼠中的Sirt1来调节脂质代谢。

为了进一步探讨Gly-tRF调控Sirt1表达的分子机制,研究人员将Gly-tRF mimicsinhibitors(由锐博生物定制合成【RiboBio】)转染到AML12细胞发现可分别降低和上调Sirt1表达。然后研究人员预测了Gly-tRF在Sirt1 3’UTR中的结合位点,并构建荧光素酶报告基因载体,发现Gly-tRF mimics和inhibitors可分别降低和增加萤光素酶的表达,结合位点突变则不能。此外,将Ago3敲低后Gly-tRF不再抑制荧光素酶的表达,并且AGO3显著富集在Gly-tRF。表明AGO3介导了Gly-tRF对基因表达的调控。

最后,研究人员检测了C3d、CYP2E1、Gly-tRF和Sirt1在AFLD患者和健康对照组肝脏组织中的表达。发现AFLD患者的脂肪积累和肝甘油三酯水平升高,C3d水平升高,并且AFLD患者的CYP2E1和Gly-tRF水平升高。此外,与健康对照组相比,AFLD患者肝脏组织中Sirt1的表达明显下降。

以上结果阐明了C3调节肝脂肪变性和炎症的分子机制。C3活化产物C3a和Asp通过介导CYP2E1的表达促进Gly-tRFs的表达,而CYP2E1通过调节Sirt1的表达促进肝脏脂肪变性的发生。补体在C3活化阶段的抑制和Gly-tRF inhibitors的治疗可能是AFLD潜在的和精准的治疗方法。

原文:Zhong F, Hu Z, Jiang K, et al. Complement C3 activation regulates the production of tRNA-derived fragments Gly-tRFs and promotes alcohol-induced liver injury and steatosis[J]. Cell research, 2019: 1.

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