产品
  • 产品
  • 内容
  • 购物车里没有产品
选择页面
服务热线: 400-686-0075

最近小编从锐博在线平台收到一些客户咨询riboEDIT CRISPR-Cas9基因编辑体系及产品,也看到不少客户已在平台上订购了产品,效果反馈还是一如既往的高效。

对大家普遍关心的CRISPR-Cas9基因编辑体系的疑问以及在使用过程中的注意事项,选择好一个适合的CRISPR体系和制定实验方案,实验也就成功了一半!这不小编再次梳理了有关CRISPR-Cas9常见问题解答和实验攻略,希望对小伙伴们有所帮助。

 

1、riboEDIT CRISPR-Cas9体系是什么?

riboEDIT CRISPR-Cas9体系是锐博生物自主开发的采用天然复合物系统(crRNA和tracrRNA)的一种CRISPR基因编辑系统,提供基于Cas9 mRNA的全RNA体系和基于Cas9蛋白的RNP体系,tracrRNA可实现大规模合成,靶向DNA目的序列的crRNA可以高通量合成,通过化学转染、显微注射或电转方式便可以便捷地进行基因编辑实验。

 

 

 

2、riboEDIT CRISPR-Cas9体系提供哪些产品?具有哪些优势?

该体系提供一系列方便高效的基因编辑产品,如果您希望筛选有效的gRNA,您可以选择订购编辑效率保证套装或标准套装,您还可以根据自己的实验情况选择:设计合成crRNA、通用型tracrRNA、Cas9 mRNA、Cas9蛋白 、mRNA转染试剂、mRNA转染对照(EGFP)、阳性对照crRNA套装、T7E1酶等产品。

采用riboEDIT CRISPR-Cas9体系的优势有:

■  锐博已申请专利,采用优化的crRNA,tracrRNA和Cas9 mRNA

■  瞬时表达,有效降低脱靶率

■  无DNA组分,不整合任何病毒或质粒基因

■  编辑效率更高,适用于哺乳动物细胞

■  毒性更低,激活先天免疫反应更小,减少细胞死亡

■  允许通过一次转染同时靶向多个基因进行编辑

■  无需繁琐的克隆构建过程,节约更多人力和时间

■  无需病毒级实验室,大大降低基因编辑对实验环境的要求

■  即用型体系,更加易用,更适合从小规模实验到大规模高通量筛选

■  兼容化学转染(mRNA转染/蛋白转染)、电转或电穿孔、显微注射

 

 

3、riboEDIT CRISPR-Cas9体系适用哪些实验?

riboEDIT CRISPR-Cas9体系可用于编辑哺乳动物的肿瘤细胞、动物受精卵、干细胞(如动物胚胎干细胞、多功能干细胞或造血干细胞等)、T细胞、原代细胞、祖细胞等,如果您希望获得哺乳动物细胞的单/多基因敲除、细胞改造、构建稳转株、构建动物受精卵、胚胎干细胞或从受精卵开始大规模构建模式动物,那么riboEDIT CRISPR-Cas9就非常适合了。

 

4、riboEDIT CRISPR-Cas9体系常见FAQ?

Q1:riboEDIT CRIPSR-Cas9体系相比于质粒载体表达Cas9和Cas9稳定表达细胞株或慢病毒系统有什么优势?

1. riboEDIT CRIPSR-Cas9的全RNA体系或Cas9蛋白体系相比质粒载体或Cas9稳定表达细胞株而言,Cas9蛋白为瞬时表达,脱靶效率低、无DNA整合风险和启动子兼容性问题,大大提高应用安全性。

2. 即用型体系,通过一步转染,5-6个工作日即可完成编辑效率检测,操作简便,显著缩短实验周期。

3. 不需要自行构建载体或包装慢病毒,不需要病毒级的实验室环境。

4. 在大部分细胞中,比质粒表达载体具有更高的基因编辑效率。

 

Q2:使用riboEDIT Cas9 mRNA进行细胞基因编辑,如何确定细胞的转染效率?

高转染效率是获得高效基因编辑效率的必要条件,可通过转染EGFP mRNA (货号:C11061-1)或其它荧光蛋白mRNA 来确定细胞的转染效率。riboFECT mRNA Transfection Reagent 转染试剂可实现各种细胞类型,包括干细胞和原代细胞的高效率、低毒性转染,从而提高Cas9 蛋白剪切和基因重组效率。对于转染试剂难以达到理想转染效果的细胞,推荐使用电转、显微注射等方式,具体实验条件需要自行优化。

 

Q3:riboEDIT Cas9 mRNA以及crRNA、trarcRNA是否可以用于显微注射?

可以,riboEDIT Cas9 mRNA 浓度为0.5μg/μL,建议显微注射前调整浓度到20-200ng/μL 范围,并采用0.2μm针式过滤器确保去除所有可能堵塞显微注射针头的颗粒物或细菌。

 

Q4:如何快速确定crRNA的有效性?

crRNA/tracrRNA 剪切效率与crRNA识别的靶序列有关,不同的crRNA剪切活性不同,推荐通过体外酶切实验,在体外酶切靶DNA片段,快速筛选有效的crRNA,获得高编辑效率的crRNA再进行后续的实验。

 

Q5:riboEDIT CRISPR-Cas9基因编辑系统识别的PAM序列是什么?

riboEDIT Cas9 mRNA和riboEDIT Cas9 Protein S. pyogenes Cas9为S. pyogenes Cas9,识别PAM序列NGG,N代表A,T,C,G。

 

Q6:riboEDIT Pre-designed crRNA如何保证低的脱靶效率?

从crRNA的设计角度,使用更严格的序列比对分析,建议每个基因至少设计3-6条crRNA进行有效性筛选。

 

Q7:T7EI酶切检测编辑效率发现无剪切条带是什么原因?

可能原因如下:

1. 细胞转染效率低,建议优化转染步骤或换用容易转染的细胞类型。

2. Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白降解,可通过设置阳性对照组(riboEDIT Positive Control crRNA #1,货号crRP0001VS)共转染排除Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白降解的问题。

3. 在细胞内,Cas9核酸酶无法接近靶位点或无法剪切靶位点,建议重新设计crRNA。

4. 没有进行DNA片段的变性、退火步骤。可通过设置阳性对照组确认实验操作是否有误。

 

Q8:琼脂糖凝胶电泳分析剪切效率时非特异性条带多,无法分析剪切效率怎么办?

可通过设置阴性对照组来区分目标剪切条带和非目标条带。必要时,需重新设计引物,或通过优化PCR条件,来降低非特异性扩增。建议采用巢式PCR,提高扩增片段的特异性。

 

Q9:T7E1 突变检测时,出现条带弥散的现象,应该如何解决?

由于T7E1 本身具有弱的非特异切割DNA 链的能力,所以遇到这种情况,可以增加DNA 用量,降低酶的用量,减少酶切时间来降低非特异切割现象。

 

Q10:对于从事诸如干细胞、原代细胞或悬浮细胞,应该选择哪一种riboEDIT CRIPSR-Cas9体系?

干细胞、原代细胞或悬浮细胞等难转染细胞,转染试剂一般很难达到理想的转染效果,电转方式更适合这类细胞的转染,根据目前文献支持,Cas9 RNP体系用于电转具有更高的基因编辑效率,对于上述难转染的细胞推荐用riboEDIT CRISPR/Cas9 RNP体系,具体实验条件需要自行优化。

 

Q11:riboEDIT Cas9 mRNA 是否可以用于多个靶点或基因的编辑?

可以,通过混合多条crRNA与tracrRNA 和riboEDT Cas9 mRNA 共转染,可实现对多个靶点或基因的编辑,最佳共转染体系需自行优化,请保证crRNA 和tracrRNA 按1:1 加入。

 

Q12:mRNA 转染与DNA 转染相比,有哪些优势?

1. DNA 转染需要进入细胞核,对于快速分裂的细胞才能达到理想的转染效果,而mRNA 转染只需进入细胞质,可大大提高有丝分裂后细胞或缓慢分裂细胞的转染效率。

2. 没有转录过程,蛋白表达更快速,缩短实验周期。

3. 更加安全,无DNA 整合风险。

 

Q13:如何用riboFECT mRNA Transfection Reagent 转染Cas9 mRNA 和sgRNA 进行基因编辑?

riboFECT mRNA Transfection Reagent 适用于转染mRNA、 lncRNA、CRISPR sgRNA 或crRNA/tracrRNA、siRNA、miRNA、小于1kb 的双链DNA 或HDR 模板。尤其适用于Cas9 mRNA 和crRNA/tracrRNA 共转染进行基因编辑, 转染步骤请参照《riboEDIT CRISPR-Cas9 体系使用说明》实验方法部分riboEDIT CRISPR/Cas9 mRNA 操作说明。当利用CRISPR 进行基因敲入,需自行优化Cas9 mRNA、crRNA/tracrRNA 及HDR 模板共转染体系,以获得最佳效果。

 

Q14:转染过程中,细胞培养基内能否含有血清及双抗?

riboFECT mRNA Transfection Reagent 是一款低毒、高效的转染试剂,血清的存在会影响转染复合物的形成,请确保在孵育转染复合物时使用的是无血清培养基。孵育结束后,转染复合物可直接加入含有或不含有血清/双抗的细胞培养基中,无需更换培养基,操作简便。

 

QQ客服
官方微信
联系电话

服务热线

400-686-0075


在线留言