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结直肠癌(CRC)是最常见的恶性肿瘤之一,其主要死亡原因是肿瘤转移。m6A是一种新兴的基因表达调控机制,METTL3参与了多种癌症类型的肿瘤进展。然而,它在CRC中的作用仍然不清楚。

2019年6月24日,中山大学肿瘤防治中心徐瑞华课题组在Molecular Cancer(IF10.679)期刊上发表了题为METTL3 facilitates tumor progression via an m6A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma的重要研究成果。首次证明了METTL3在促进CRC进展中的作用,并揭示了METTL3促进CRC进展的m6A-IGF2BP2依赖性机制,为CRC预后提供了更具预测价值的新潜在生物标志物组合(包括“writer”METTL3、“reader”IGF2BP2和“target”SOX 2)。

METTL3在CRC患者中高表达,导致SOX2转录本m6A甲基化水平升高。随后,甲基化的SOX2被m6A“reader”IGF2BP2识别,以维持其mRNA的稳定性和表达。最后,SOX2表达的增加通过SOX2的下游靶标促进CRC细胞的干性和转移,导致CRC的进展。

实验方法

1、首先,采用Western blot、real-time PCR (RT-qPCR)和免疫组化(IHC)检测METTL3在细胞株和患者组织中的表达。

2、采用MeRIP-seq(由锐博生物提供)和转录组RNA测序(RNA-seq)筛选METTL3的靶基因。

3、METTL3体内/体外生物学功能研究。

4、采用RNA pull-down和RNA免疫沉淀法研究靶基因的特异性结合。并采用RNA稳定性分析检测METTL3下游基因的半衰期。

实验结果

1、 METTL3在转移性CRC中高表达,且与预后不良有关

研究人员为了评估CRC中m6A WERs ( writers, erasers,readers )的表达谱,通过TCGA数据库发现METTL3、YTHDF1、YTHDF2、IGF2BP1、IGF2BP2在CRC肿瘤组织中显著增加。其中METTL3在大多数人类癌症中普遍高表达,因此本研究探索了METTL3在CRC中的功能和临床意义。发现METTL3在复发性CRC组织和转移性肝组织中持续升高,并且METTL3 mRNA和蛋白水平在CRC细胞系和CRC患者组织中明显增加。

随后,研究人员探索了METTL3与CRC的临床意义,IHC实验发现原发性CRC组织中METTL3染色增加。同样,METTL3在匹配的淋巴结和肝转移灶中也显著升高。并且发现METTL3高表达的患者从标准化疗中获益较差。此外,METTL3高表达的CRC患者总生存期(OS)和无进展生存期(DFS)均较短,表明METTL3表达可以作为CRC患者OS和DFS的预后标志物。

2、 SOX2受METTL3介导的m6A修饰调节

为了研究METTL3在肿瘤进展中的潜在作用,研究人员首先注意到分别从单个患者的腹部转移灶和原发肿瘤分离出的SW620和SW480细胞系表现出不同的转移能力,并且与SW480细胞相比,SW620细胞中的METTL3水平升高,这表明METTL3与转移之间存在一定的联系。因此,研究人员对SW480、SW620和METTL3敲低的SW620细胞进行MeRIP-seq(由锐博生物提供)和RNA-seq,发现与SW480细胞相比,SW620细胞中有733个高甲基化的m6A峰,其mRNA表达水平较高,称为转移相关的超高峰;METTL3敲低的SW620细胞中有3393个低甲基化m6A峰,其mRNA表达较低,称为METTL3相关的低下峰。两组峰共同拥有192个特定峰,对应158个基因,主要富集在干细胞分化通路,说明该通路可能受METTL3调控,通过m6A机制促进肿瘤转移。

接着,从m6A-seq数据中筛选了4个干细胞分化通路中的基因:SEMA3A、BCHE、ZFP36L2和SOX2。基因特异性m6A pull down实验和qPCR分析表明:与SW480细胞相比,SW620细胞中SOX2、ZFP36L2和SEMA3A的m6A水平增加。然而,与对照组相比,在METTL3敲低CRC细胞中,SOX2表现出最一致的m6A和mRNA水平的下降。此外,在SW620和HCT116细胞中,METTL3抑制后,SOX2蛋白水平显著降低。考虑到SOX2被认为是促进肿瘤发生和参与肿瘤转移的重要CSC标志物,推测METTL3以m6A依赖性方式促进CRC的干性和转移,从而维持SOX2的表达。

3、 METTL3在体外促进CRC细胞的干性

为了验证以上推测,研究人员通过实验发现METTL3抑制的SW620和HCT116细胞中的球体数量和大小减少、干细胞发生率显著降低,细胞集落形成和侵袭能力也受到损害。并且METTL3敲低的SW620和HCT116细胞对基于奥沙利铂的化疗敏感性增加。此外,还发现METTL3抑制后,CSC表面抗原如CD133、CD44、上皮细胞粘附分子(EpCAM)在SW620和HCT116细胞中的表达显著降低。SOX2下游基因CCND1、MYC和POU5F1的表达在METTL3敲低的SW620和HCT116细胞中被一致地抑制。从而揭示了METTL3的致癌作用,特别是在促进CRC细胞的肿瘤自我更新、细胞侵袭和化疗耐药方面。而在METTL3敲低和对照CRC细胞中过表达SOX2则可使球体形成增加,并出现明显的化疗耐药表型。表明METTL3通过维持CRC中SOX2的表达,在促进干细胞特性方面发挥了重要作用。

4、 METTL3在体内驱动CRC的肿瘤发生和转移

接下来,研究人员通过皮下异种移植试验以确定METTL3在体内的功能。发现植入METTL3敲低的SW620和HCT116细胞时,肿瘤生长速度较慢,异种移植肿瘤重量减少。此外,与尾静脉注射METTL3敲低细胞的小鼠相比,注射对照SW620细胞的小鼠表现出更多的肺转移性结节。值得注意的是,在METTL3敲低的SW620细胞中,致瘤性CRC细胞的发生率显著降低。此外,SOX2过表达增加了对照和METTL3敲低SW620细胞中肿瘤发生率和致瘤细胞的频率。表明METTL3通过维持CRC中的SOX2表达促进肿瘤发生和转移灶的形成。

随后,通过两种PDX模型来评估METTL3通过肿瘤内RNAi注射的潜在治疗效果。发现METTL3 siRNA治疗组肿瘤体积明显低于对照组。此外,分离PDX肿瘤并进行IHC染色评估,发现METTL3 siRNA治疗组中METTL3、SOX2和EpCAM表达的染色减少。进一步强调了METTL3在体内CRC肿瘤发生和转移中的重要作用。

5、 IGF2BP2通过m6A依赖性方式增强SOX2 mRNA稳定性

为了阐明SOX2的特异性m6A readers,并确定SOX2调节的m6A依赖性机制,研究人员通过RNA pull-down来筛选SOX2相关的m6A readers。发现IGF2BP2在SW620和HCT116细胞中特异性地结合了SOX2全长转录本。值得注意的是,IGF2BP2主要结合于SOX2 CDS区域,且在m6A motif缺失后,特异性结合受到显著损害。RIP实验也证实了IGF2BP2和SOX2 mRNA直接相互作用。TCGA数据库分析发现IGF2BP2和SOX2表达正相关,暗示其潜在的正向调控机制。随后,研究人员通过siRNA抑制IGF2BP2后,发现SOX2蛋白和mRNA表达显著降低,且SOX2下游基因的表达也降低。此外,抑制METTL3可导致IGF2BP2和SOX2转录本之间的直接相互作用受损。

此外,研究人员评估了METTL3或IGF2BP2抑制的CRC细胞及对照细胞中的RNA衰变速率。发现当METTL3或IGF2BP2抑制时,SOX2 mRNA表达开始降低并且SOX2 mRNA半衰期持续显著缩短。表明甲基化的SOX2转录本被m6A“reader”IGF2BP2(可保持转录本的稳定性以防止其降解)直接识别,并通过m6A-IGF2BP2依赖性机制自然地增加其表达。

6、 CRC中METTL3、SOX2和IGF2BP2的临床相关性

最后,为了探索METTL3、IGF2BP2和SOX2的临床相关性,研究人员通过IHC实验发现CRC组织中SOX2和IGF2BP2表达均显著升高,Kaplan-Meier生存分析表明高表达SOX2和IGF2BP2与较短的总生存期和无进展生存期时间显著相关。值得注意的是,SOX2在CRC组织中的表达与METTL3和IGF2BP2呈正相关。此外,METTL3或IGF2BP2表达与SOX2下游基因CCND1、MYC、POU5F1也呈正相关。采用Cox回归分析METTL3、SOX2和IGF2BP2均显著增加了死亡的危险比(HR),表明这三个基因是独立的预后因素。

接着,研究人员生成一个含有METTL3、SOX2和IGF2BP2的新IHC panel来预测CRC的预后。Kaplan-Meier生存分析表明,具有三种高表达标志物的患者的总生存期和无进展生存期最短。此外,ROC曲线分析发现与任何单个标记相比,新IHC panel(METTL3、SOX2和IGF2BP2)显示出总体生存率的可加性预测值。

总体而言,研究结果显示了作为致癌基因的METTL3通过CRC细胞中的m6A-IGF2BP2依赖性机制维持SOX2表达,并且揭示了一个用于CRC预后预测的潜在生物标志物组。

原文:Li T, Hu P S, Zuo Z, et al. METTL3 facilitates tumor progression via an m 6 A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma[J]. Molecular cancer, 2019, 18(1): 112.

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