riboEDIT™ Designed crRNA采用锐博生物优化的生物信息学设计，客户无需具备crRNA/sgRNA设计经验，crRNA包含20个与目标DNA序列互补配对的核苷酸（原间隔序列）和与tracrRNA互补配对的重复序列，涵盖人类和小鼠基因，每个基因设计合成3 – 6段单独的sgRNA，经过严格的PAGE纯化，其他物种crRNA设计需另行评估。

人源和小鼠设计合成crRNA每条的价格：1250元/5nmol, 1650元/10nmol，大规格定制请在线询价，提供crRNA序列设计服务。

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riboEDIT tracrRNA采用化学合成通用型tracrRNA，经PAGE纯化，能够抗核酸酶，能与锐博生物的crRNA结合形成crRNA/tracrRNA复合物，共同指导Cas9蛋白切割双链DNA。需要注意的是，riboEDIT tracrRNA与riboEDIT crRNA是专利配套体系，两者必须配套使用（不兼容其他体系的crRNA）。

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锐博生物提供方便高效的基因编辑套装产品：效率保证套装和标准套装。效率保证套装针对人源基因，利用设计软件挑选评分高的5条crRNA进行合成，基于Cas9 mRNA的体系而配置必备试剂，包括tracrRNA、Cas9 mRNA、mRNA转染试剂、阳性对照crRNA套装、T7E1酶及配套缓冲液等，提供即用型的基因编辑套餐。其中效率保证套装可以实现MHCC97H细胞的T7E1酶切效率至少1条达到30%以上并提供相应的售后服务，标准套装不提供任何编辑效率的保证。

riboEDIT™ CRISPR-Cas9套装产品

产品名称	riboEDIT CRISPR-Cas9 mRNA Set, 20T​
编辑效率保证套装*	套装编号：crG00001，点击开始定制
标准套装	套装编号：crS00001，点击开始定制

 *效率保证装：按说明书操作条件下，对MHCC97H细胞的T7E1酶切效率可实现至少1条达到30%以上，若5条均低于30%，客户须提供MHCC97H转染效率与检测方法步骤，经技术分析确认,免费重新优化设计，挑选合成5条crRNA并提供实验技术指导。标准套装不提供编辑效率有效性保证和免费重合服务，更多信息请见说明书。

套装名称	套装产品内容
riboEDIT CRISPR-Cas9 mRNA Set （基于mRNA的全RNA体系/针对人源细胞）	riboEDIT™ Designed crRNA（设计合成5条crRNA，每条5nmol） riboEDIT™ tracrRNA， 5nmol riboEDIT™ Positive Control crRNA Validation Set for Human *,  3*5nmol riboFECT™ mRNA Transfection Reagent, 75ul riboEDIT™ Cas9 mRNA (0.5ug/ul), 20ug riboEDIT™ T7EI Enzyme (10U/ul), 100U

**Positive Control crRNA Validation Set for Human包括针对人源的阳性对照crRNA 5nmol、正向引物5nmol和反向引物5nmol

锐博生物提供适用于大规模筛选的化学CRISPR crRNA文库，文库采用优化的设计算法提高特异性，相比单条crRNA更具经济性和通量性，以冻存管形式提供单孔细胞表型分析与高内涵高通量筛选分析，提供基因家族、特殊基因文库，crRNA定制文库为20个基因起订。若定制100个基因以上的，可按要求提供96孔PCR板封装形式。

CRISPR crRNA文库优势

锐博优化算法设计crRNA，特异高效
每个靶点设计4条独特的crRNA
灵活经济定制，20个基因起订
单孔或阵列细胞表型结果
每批经过PAGE纯化和质谱检测
提供冻存管或96孔板封装
提供单条分装或多条预混PreMix形式
无需使用者具备crRNA/sgRNA设计经验
配套提供tracrRNA

riboEDIT CRISPR crRNA文库一览表

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riboEDIT™ crRNA阳性对照套装用于检测基因编辑体系的正确性，该套装包括阳性对照crRNA、正向引物和反向引物，各5nmol。

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riboEDIT Cas9 mRNA为体外转录生成，是属于spCas9 mRNA，具有帽子和polyA尾巴结构，编码序列为人源密码子优化的S. pyogenes Cas9，带有核定位信号（NLS），C端的一个1XFLAG标签，5’非翻译区(5’UTR)及3’非翻译区(3’UTR)，以促进mRNA的翻译和提高mRNA的稳定性，Cas9 mRNA可在细胞内瞬时表达Cas9蛋白（即spCas9蛋白），在crRNA和tracrRNA复合物指导下对目的DNA序列进行剪切，相比质粒或病毒体系，有效地降低CRISPR基因编辑的脱靶效应，适用于哺乳动物细胞基因编辑。

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riboEDIT Cas9 Protein是riboEDIT CRISPR-Cas9的RNP体系的重要组成部分，RNP体系包括了crRNA和tracrRNA和Cas9蛋白，tracrRNA可实现大规模合成，靶向DNA目的序列的crRNA可以高通量合成，Cas9蛋白为热稳定S.pyogenes来源的核酸酶（又称为spCas9）。此RNP体系不需要自行构建gRNA表达载体，无需在病毒级实验室中操作，无DNA组分，并且可实现多个crRNA指导下的多靶点编辑，大大简化前期实验步骤。该即用型的RNP体系适合化学转染（借助蛋白转染试剂）、显微注射或电转（电穿孔）进行基因编辑。500pmol的Cas9蛋白相当于83ug，一般情况下每孔转染1-2ug的Cas9蛋白，可转染超过40次以上。

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riboEDIT T7EI Enzymes是经E.coli重组表达的结构特异性酶，可识别并切割非完全配对的双链DNA、十字形结构DNA、 Holliday交叉DNA、异源双链DNA，或缓慢地切割带有切刻的双链DNA；可有效识别大于1个碱基的基因错配，广泛应用于由CRISPR-Cas9、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)等工程核酸酶所介导的基因突变检测。试剂盒提供了T7EI Enzyme、缓冲液和无酶水等组分。产品为低温运输，收到产品后，请于-20℃保存，可以稳定保存1年，使用前请瞬时离心。

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riboFECT™ mRNA Transfection Reagent是一种专门用于长链RNA分子的转染试剂，极具生物相容性，转染效率高，细胞毒性小，适合各种长链RNA分子（如mRNA，lncRNA等）的转染实验，可转染的长链RNA长度达4kb，已经成功实现了几十种细胞类型的高效转染，包括原代细胞、干细胞等难以转染的细胞类型。该转染试剂的最大特点是低毒、高效，转染时无需进行培养基更换操作，方便，快速。产品为常温运输。收到产品后，请于2-8℃保存，可以稳定保存一年，使用前请瞬时离心。

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riboEDIT EGFP mRNA在转染试剂作用下进入目的细胞之后会表达绿色荧光EGFP蛋白，常作为检测CRISPR-Cas9体系转染效率的工具，提供的EGFP mRNA浓度为500ng/μL。

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riboEDIT™ Cas9 Expression mRNA具有高效的基因组剪切效率

图1. MHCC97H细胞共转染10pmol riboEDIT™ crRNA、10pmol riboEDIT™ tracrRNA和1ug riboEDIT™ Cas9 mRNA，48小时后 riboEDIT™ T7EI Enzyme酶切检测靶位点的剪切效率，候选7个靶基因的剪切条带及编辑效率。如图所示，#1#2表示同一基因不同位点设计的2条crRNA。

riboEDIT Cas9 RNP具有高效的基因组剪切效率

图2. MHCC97H细胞共转染6pmol riboEDIT™ crRNA、6pmol riboEDIT™ tracrRNA和6pmol riboEDIT™ Cas9 Protein，48小时后 riboEDIT™ T7EI Enzyme酶切检测靶位点的剪切效率，候选7个靶基因的剪切条带及编辑效率。如图所示，#1#2表示同一基因不同位点设计的2条crRNA。

图3.  riboEDIT™ CRISPR-Cas9 mRNA基因编辑体系与riboEDIT Cas9 RNP复合物具有等同的靶位点剪切活性。

1. riboEDIT™ CRIPSR-Cas9体系的gRNA是何种形式的？是100nt的体外转录合成的gRNA吗？

答：有研究者体外转录或克隆形成的single guide RNA（即sgRNA），长度约100 mer，通过摇菌培养、载体表达、挑选阳性克隆、测序鉴定等，或通过包病毒步骤，非常繁琐，而且纯度低、批次质量难以保证。而构建好的gRNA质粒、慢病毒、腺病毒会整合到宿主基因，载体体积大，免疫源性，转染效率低、细胞毒性大、死亡率高、激活先天免疫等。

riboEDIT CRIPSR-Cas9系统采用近两年来被全球科学家越来越多采用的天然复合物gRNA，即crRNA和tracrRNA，无需体外转录，采用高通量化学合成以确保其纯度、效力和批次稳定性。因不需要载体或病毒，上述问题可避免。其中，crRNA和tracrRNA为专利技术优化，缩短了碱基序列长度。不同于常规gRNA，由crRNA、tracrRNA与S. pyogenes Cas9（编码序列经人源密码子优化）构成编辑效率更高的CRISPR-Cas9体系，如下图所示。

2. riboEDIT CRIPSR-Cas9体系相比于质粒载体表达Cas9和Cas9稳定表达细胞株或慢病毒系统有什么优势？

答：（1）riboEDIT™ CRIPSR-Cas9的全RNA体系或Cas9蛋白体系相比质粒载体或Cas9稳定表达细胞株而言，Cas9蛋白为瞬时表达，脱靶效率低、无DNA整合风险和启动子兼容性问题，大大提高应用安全性。
（2）即用型体系，通过一步转染，5-6个工作日即可完成编辑效率检测，操作简便，显著缩短实验周期。
（3）不需要自行构建载体或包装慢病毒，不需要病毒级的实验室环境。
（4）在大部分细胞中，比质粒表达载体具有更高的基因编辑效率。

3.使用riboEDIT Cas9 mRNA进行细胞基因编辑，如何确定细胞的转染效率？

答：高转染效率是获得高效基因编辑效率的必要条件，可通过转染EGFP mRNA （货号：C11061-1）或其它荧光蛋白mRNA 来确定细胞的转染效率。riboFECT mRNA转染试剂可实现各种细胞类型，包括干细胞和原代细胞的高效率、低毒性转染，从而提高Cas9 蛋白剪切和基因重组效率。对于转染试剂难以达到理想转染效果的细胞，推荐使用电转、显微注射等方式，具体实验条件需要自行优化。

4.riboEDIT Cas9 mRNA以及crRNA、trarcRNA是否可以用于显微注射？

答：可以，riboEDIT Cas9 mRNA 浓度为0.5μg/μL，建议显微注射前调整浓度到20-200ng/μL 范围，并采用0.2μm针式过滤器确保去除所有可能堵塞显微注射针头的颗粒物或细菌。

5.如何快速确定crRNA的有效性？

答：crRNA/ tracrRNA 剪切效率与crRNA识别的靶序列有关，不同的crRNA剪切活性不同，推荐通过体外酶切实验，在体外酶切靶DNA片段，快速筛选有效的crRNA，获得高编辑效率的crRNA再进行后续的实验。

6. riboEDIT™ CRISPR-Cas9基因编辑系统识别的PAM序列是什么？

答： riboEDIT™ Cas9 mRNA和riboEDIT™ Cas9 Protein S. pyogenes Cas9为S. pyogenes Cas9，识别PAM序列NGG，N代表A，T，C，G。

7. riboEDIT™ Pre-designed crRNA如何保证低的脱靶效率？

答：从crRNA的设计角度，使用更严格的序列比对分析，建议每个基因至少设计3-6条crRNA进行有效性筛选。

8. T7EI酶切检测编辑效率发现无剪切条带是什么原因？

答：可能原因如下：
（1） 细胞转染效率低，建议优化转染步骤或换用容易转染的细胞类型。
（2） Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白降解，可通过设置阳性对照组（riboEDIT Positive Control crRNA #1，货号crRP0001VS）共转染和排除Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白降解的问题。
（3） 在细胞内，Cas9核酸酶无法接近靶位点或无法剪切靶位点，建议重新设计crRNA。
（4） 没有进行DNA片段的变性、退火步骤。可通过设置阳性对照组确认实验操作是否有误。

9. 琼脂糖凝胶电泳分析剪切效率时非特异性条带多，无法分析剪切效率怎么办？

答：可通过设置阴性对照组来区分目标剪切条带和非目标条带。必要时，需重新设计引物，或通过优化PCR条件，来降低非特异性扩增。建议采用巢式PCR，提高扩增片段的特异性。

10. T7E1 突变检测时，出现条带弥散的现象，应该如何解决？

答: 由于T7E1 本身具有弱的非特异切割DNA 链的能力，所以遇到这种情况，可以增加DNA 用量，降低酶的用量，减少酶切时间来降低非特异切割现象。

11.对于从事诸如干细胞、原代细胞或悬浮细胞，应该选择哪一种riboEDIT™ CRIPSR-Cas9体系？

答: 干细胞、原代细胞或悬浮细胞等难转染细胞，转染试剂一般很难达到理想的转染效果，电转方式更适合这类细胞的转染，根据目前文献支持，Cas9 RNP体系用于电转具有更高的基因编辑效率，对于上述难转染的细胞推荐用riboEDIT™ CRISPR/Cas9 RNP体系，具体实验条件需要自行优化。

12.riboEDIT Cas9 mRNA 是否可以用于多个靶点或基因的编辑？

答：可以，通过混合多条crRNA与tracrRNA 和riboEDT Cas9 mRNA 共转染，可实现对多个靶点或基因的编辑，最佳共转染体系需自行优化，请保证crRNA 和tracrRNA 按1:1 加入。

13.mRNA 转染与DNA 转染相比，有哪些优势？

答：（1）DNA 转染需要进入细胞核，对于快速分裂的细胞才能达到理想的转染效果，而mRNA 转染只需进入细胞质，可大大提高有丝分裂后细胞或缓慢分裂细胞的转染效率。（2）没有转录过程，蛋白表达更快速，缩短实验周期。（3） 更加安全，无DNA 整合风险。

14.如何用riboFECT™ mRNA Transfection Reagent 转染Cas9 mRNA 和sgRNA 进行基因编辑？

答：riboFECT™ mRNA Transfection Reagent 适用于转染mRNA、 lncRNA、CRISPR sgRNA 或crRNA/tracrRNA、siRNA、miRNA、小于1kb 的双链DNA 或HDR 模板。尤其适用于Cas9 mRNA 和crRNA/tracrRNA 共转染进行基因编辑， 转染步骤请参照《riboEDIT™ CRISPR-Cas9 体系使用说明》实验方法部分riboEDIT™ CRISPR/Cas9 mRNA 操作说明。当利用CRISPR 做基因敲入，需自行优化Cas9 mRNA、crRNA/tracrRNA 及HDR 模板共转染体系，以获得最佳效果。

15.转染过程中，细胞培养基内能否含有血清及双抗？

答：riboFECT™ mRNA Transfection Reagent 是一款低毒、高效的转染试剂，血清的存在会影响转染复合物的形成，请确保在孵育转染复合物时使用的是无血清培养基。孵育结束后，转染复合物可直接加入含有或不含有血清/双抗的细胞培养基中，无需更换培养基，操作简便。

[1]Hendel A, et al.Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells[J]. Nature Biotechnology,2015,33(9):985-989.

[2]Doetschman T, et al. Gene Editing With CRISPR /Cas9 RNA-Directed Nuclease[J].Circulation reseach,2017,120(5): 876-894.

[3] Serif M, et al.One-step generation of multiple gene knock-outs in the diatom Phaeodactylum tricornutum by DNA-free genome editin[J].Nature communication, 2018,9(1):3924.

[4]Vakulskas CA, et al.A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells[J]. Nature Medicine,2018,(8):1216-1224.

[5]Martin RM, et al.Highly Efficient and Marker-free Genome Editing of Human Pluripotent Stem Cells by CRISPR-Cas9 RNP and AAV6 Donor-Mediated Homologous Recombination[J].Cell Stem Cell,2019,24(5):821-828

[6]Martin RM, et al.Engineered CRISPR-Cas12a variants with increased activities and improved targeting ranges for gene, epigenetic and base editing[J].Nature Biotechnology,2019,24(5):821-828.

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