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riboEDIT™ CRISPR-Cas9是锐博自主开发采用天然复合物系统的基因编辑体系,gRNA采用crRNA和tracrRNA,提供基于Cas9 mRNA的全RNA体系和基于spCas9蛋白的RNP体系,tracrRNA可大规模合成,靶向DNA目的序列的crRNA可高通量合成,通过化学转染、显微注射或电转方式进行基因编辑。该体系为即用型体系(Read-to-Use),不需要自行构建gRNA载体或Cas9载体,无需病毒实验室条件,无DNA组分,不整合病毒或质粒基因,可实现单靶点或多靶点编辑,极大简化基因编辑的难度和步骤,还提供编辑效率保证CRISPR-Cas9套装并配套必需试剂,为基因编辑实验提供更加方便、省时、可靠和高效的解决方案,也是大规模基因编辑文库筛选的理想选择。

体系优势

锐博专利情况:用于DNA编辑的系统及其应用,中国专利申请号:108977442A, PCT申请号:CN2018/088105

1.锐博专利技术:优化的gRNA(crRNA与tracrRNA)和Cas9 mRNA
2.瞬时表达,有效降低脱靶率
3.无DNA组分,不整合任何病毒或质粒基因
4.编辑效率更高,适用于哺乳动物细胞
5.毒性更低,激活先天免疫反应更小,减少细胞死亡
6.允许一次转染同时靶向编辑多个基因,且毒性更低
7.无需繁琐的克隆构建过程,节约更多人力和时间
8.无需病毒级实验室,大大降低基因编辑对实验环境的要求
9.即用型体系,更加易用,更适合从小规模实验到大规模高通量筛选
10.兼容多种导入模式:化学转染(mRNA转染/蛋白转染)、电转或电穿孔、显微注射等

应用领域

riboEDIT CRISPR-Cas9体系可用于哺乳动物细胞的基因编辑,如肿瘤细胞、干细胞(动物胚胎干细胞、多功能干细胞、造血干细胞等)、原代细胞、祖细胞、细胞治疗(CAR-T)、动物模型(受精卵)等,适合进行单/多基因敲除/插入细胞改造、构建稳转株动物受精卵或干细胞,或从受精卵开始进行大规模构建模式动物

CRISPR操作流程图:更简单,步骤更少,Ready-To-Use

CRISPR-Cas9全RNA体系:效率保证套装、标准套装

锐博生物提供方便高效的基因编辑套装产品:效率保证套装标准套装效率保证套装针对人源基因,利用设计软件挑选评分高的5条crRNA进行合成,基于Cas9 mRNA的体系而配置必备试剂,包括tracrRNA、Cas9 mRNA、mRNA转染试剂、阳性对照crRNA套装、T7E1酶及配套缓冲液等,提供即用型的基因编辑套餐。其中效率保证套装可以实现MHCC97H细胞的T7E1酶切效率至少1条达到30%以上并提供相应的售后服务,标准套装不提供任何编辑效率的保证。

riboEDIT™ CRISPR-Cas9套装产品

产品名称 riboEDIT CRISPR-Cas9 mRNA Set, 20T​
编辑效率保证套装* 套装编号:crG00001
标准套装 套装编号:crS00001

 *效率保证装:按说明书操作条件下,对MHCC97H细胞的T7E1酶切效率可实现至少1条达到30%以上,若5条均低于30%,客户须提供MHCC97H转染效率与检测方法步骤,经技术分析确认,免费重新优化设计,挑选合成5条crRNA并提供实验技术指导。标准套装不提供编辑效率有效性保证和免费重合服务,更多信息请见说明书。

套装名称 套装产品内容
riboEDIT CRISPR-Cas9 mRNA Set
(基于mRNA的全RNA体系/针对人源细胞)
riboEDIT™ Designed crRNA(设计合成5条crRNA,每条5nmol)
riboEDIT™ tracrRNA, 5nmol
riboEDIT™ Positive Control crRNA Validation Set for Human *,  3*5nmol
riboFECT™ mRNA Transfection Reagent, 75ul
riboEDIT™ Cas9 mRNA (0.5ug/ul), 20ug
riboEDIT™ T7EI Enzyme (10U/ul), 100U

**Positive Control crRNA Validation Set for Human包括针对人源的阳性对照crRNA 5nmol、正向引物5nmol和反向引物5nmol

设计合成crRNA:靶向目的DNA序列

riboEDIT™ Designed crRNA采用锐博生物优化的生物信息学设计,客户无需具备crRNA/sgRNA设计经验,crRNA包含20个与目标DNA序列互补配对的核苷酸(原间隔序列)和与tracrRNA互补配对的重复序列,涵盖人类和小鼠基因,每个基因设计合成3 – 6段单独的sgRNA,经过严格的PAGE纯化,其他物种crRNA设计需另行评估。

人源和小鼠设计合成crRNA每条的价格1250元/5nmol, 1650元/10nmol,大规格定制请在线询价,提供crRNA序列设计服务。

通用型tracrRNA:与crRNA形成gRNA

riboEDIT tracrRNA采用化学合成通用型tracrRNA,经PAGE纯化,能够抗核酸酶,能与锐博生物的crRNA结合形成crRNA/tracrRNA复合物,共同指导Cas9蛋白切割双链DNA。需要注意的是,riboEDIT tracrRNA与riboEDIT crRNA是专利配套体系,两者必须配套使用(不兼容其他体系的crRNA)。

crRNA阳性对照套装:检测基因编辑体系正确性

riboEDIT™ crRNA阳性对照套装用于检测基因编辑体系的正确性,该套装包括阳性对照crRNA、正向引物和反向引物,各5nmol。

Cas9 mRNA:瞬时表达,剪切双链DNA

riboEDIT Cas9 mRNA为体外转录生成,又称为spCas9 mRNA,具有帽子和polyA尾巴结构,编码序列为人源密码子优化的S. pyogenes Cas9,带有核定位信号(NLS),C端的一个1XFLAG标签,5’非翻译区(5’UTR)及3’非翻译区(3’UTR),以促进mRNA的翻译和提高mRNA的稳定性,适用于哺乳动物细胞基因编辑。Cas9 mRNA可在细胞内瞬时表达Cas9蛋白(或spCas9蛋白),在crRNA和tracrRNA复合物指导下对目的DNA序列进行剪切。

Cas9 Protein:剪切双链DNA

riboEDIT Cas9 Protein是riboEDIT CRISPR-Cas9的RNP体系的重要组成部分,RNP体系包括了crRNA和tracrRNA和Cas9蛋白,tracrRNA可实现大规模合成,靶向DNA目的序列的crRNA可以高通量合成,Cas9蛋白为热稳定S.pyogenes来源的核酸酶(又称为spCas9)。此RNP体系不需要自行构建gRNA表达载体,无需在病毒级实验室中操作,无DNA组分,并且可实现多个crRNA指导下的多靶点编辑,大大简化前期实验步骤。该即用型的RNP体系适合化学转染(借助蛋白转染试剂)、显微注射或电转(电穿孔)进行基因编辑。500pmol的Cas9蛋白相当于83ug,一般情况下每孔转染1-2ug的Cas9蛋白,可转染超过40次以上。

应用举例:riboEDIT™ CRISPR-Cas9 mRNA与RNP体系高效基因编辑效率

riboEDIT™ Cas9 Expression mRNA具有高效的基因组剪切效率

图1. MHCC97H细胞共转染10pmol riboEDIT™ crRNA、10pmol riboEDIT™ tracrRNA和1ug riboEDIT™ Cas9 mRNA,48小时后 riboEDIT™ T7EI Enzyme酶切检测靶位点的剪切效率,候选7个靶基因的剪切条带及编辑效率。如图所示,#1#2表示同一基因不同位点设计的2条crRNA。

riboEDIT Cas9 RNP具有高效的基因组剪切效率

图2. MHCC97H细胞共转染6pmol riboEDIT™ crRNA、6pmol riboEDIT™ tracrRNA和6pmol riboEDIT™ Cas9 Protein,48小时后 riboEDIT™ T7EI Enzyme酶切检测靶位点的剪切效率,候选7个靶基因的剪切条带及编辑效率。如图所示,#1#2表示同一基因不同位点设计的2条crRNA。

图3.  riboEDIT™ CRISPR-Cas9 mRNA基因编辑体系与riboEDIT Cas9 RNP复合物具有等同的靶位点剪切活性。

CRISPR常见问题F&Q

1. riboEDIT™ CRIPSR-Cas9体系的gRNA是何种形式的?是100nt的体外转录合成的gRNA吗?

答:有研究者体外转录或克隆形成的single guide RNA(即sgRNA),长度约100 mer,通过摇菌培养、载体表达、挑选阳性克隆、测序鉴定等,或通过包病毒步骤,非常繁琐,而且纯度低、批次质量难以保证。而构建好的gRNA质粒、慢病毒、腺病毒会整合到宿主基因,载体体积大,免疫源性问题,导致转染效率低、细胞毒性大、死亡率高、激活先天免疫等。

riboEDIT CRIPSR-Cas9系统采用天然复合物的gRNA,即crRNA(具有靶点向导性)和tracrRNA(通用型),无需体外转录,采用高通量化学合成以确保其纯度、效力和批次稳定性。因不需要载体或病毒,上述问题可避免。其中,crRNA和tracrRNA为专利技术优化,缩短了碱基序列长度。不同于常规gRNA,由crRNA、tracrRNA与S. pyogenes Cas9(编码序列经人源密码子优化)构成编辑效率更高的CRISPR-Cas9体系,如下图所示。

2. riboEDIT CRIPSR-Cas9体系相比于质粒载体表达Cas9和Cas9稳定表达细胞株或慢病毒系统有什么优势?

答:(1)riboEDIT™ CRIPSR-Cas9的全RNA体系或Cas9蛋白体系相比质粒载体或Cas9稳定表达细胞株而言,Cas9蛋白为瞬时表达,脱靶效率低、无DNA整合风险和启动子兼容性问题,大大提高应用安全性。
(2)即用型体系,通过一步转染,5-6个工作日即可完成编辑效率检测,操作简便,显著缩短实验周期。
(3)不需要自行构建载体或包装慢病毒,不需要病毒级的实验室环境。
(4)在大部分细胞中,比质粒表达载体具有更高的基因编辑效率。

3.使用riboEDIT Cas9 mRNA进行细胞基因编辑,如何确定细胞的转染效率?

答:高转染效率是获得高效基因编辑效率的必要条件,可通过转染EGFP mRNA (货号:C11061-1)或其它荧光蛋白mRNA 来确定细胞的转染效率。riboFECT mRNA转染试剂可实现各种细胞类型,包括干细胞和原代细胞的高效率、低毒性转染,从而提高Cas9 蛋白剪切和基因重组效率。对于转染试剂难以达到理想转染效果的细胞,推荐使用电转、显微注射等方式,具体实验条件需要自行优化。

4.riboEDIT Cas9 mRNA以及crRNA、trarcRNA是否可以用于显微注射?

答:可以,riboEDIT Cas9 mRNA 浓度为0.5μg/μL,建议显微注射前调整浓度到20-200ng/μL 范围,并采用0.2μm针式过滤器确保去除所有可能堵塞显微注射针头的颗粒物或细菌。

5.如何快速确定crRNA的有效性?

答:crRNA/ tracrRNA 剪切效率与crRNA识别的靶序列有关,不同的crRNA剪切活性不同,推荐通过体外酶切实验,在体外酶切靶DNA片段,快速筛选有效的crRNA,获得高编辑效率的crRNA再进行后续的实验。

6. riboEDIT™ CRISPR-Cas9基因编辑系统识别的PAM序列是什么?

答: riboEDIT™ Cas9 mRNA和riboEDIT™ Cas9 Protein S. pyogenes Cas9为S. pyogenes Cas9,识别PAM序列NGG,N代表A,T,C,G。

7. riboEDIT™ Pre-designed crRNA如何保证低的脱靶效率?

答:从crRNA的设计角度,使用更严格的序列比对分析,建议每个基因至少设计3-6条crRNA进行有效性筛选。

8. T7EI酶切检测编辑效率发现无剪切条带是什么原因?

答:可能原因如下:
(1) 细胞转染效率低,建议优化转染步骤或换用容易转染的细胞类型。
(2) Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白降解,可通过设置阳性对照组(riboEDIT Positive Control crRNA #1,货号crRP0001VS)共转染和排除Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白降解的问题。
(3) 在细胞内,Cas9核酸酶无法接近靶位点或无法剪切靶位点,建议重新设计crRNA。
(4) 没有进行DNA片段的变性、退火步骤。可通过设置阳性对照组确认实验操作是否有误。

9. 琼脂糖凝胶电泳分析剪切效率时非特异性条带多,无法分析剪切效率怎么办?

答:可通过设置阴性对照组来区分目标剪切条带和非目标条带。必要时,需重新设计引物,或通过优化PCR条件,来降低非特异性扩增。建议采用巢式PCR,提高扩增片段的特异性。

10. T7E1 突变检测时,出现条带弥散的现象,应该如何解决?

答: 由于T7E1 本身具有弱的非特异切割DNA 链的能力,所以遇到这种情况,可以增加DNA 用量,降低酶的用量,减少酶切时间来降低非特异切割现象。

11.对于从事诸如干细胞、原代细胞或悬浮细胞,应该选择哪一种riboEDIT™ CRIPSR-Cas9体系?

答: 干细胞、原代细胞或悬浮细胞等难转染细胞,转染试剂一般很难达到理想的转染效果,电转方式更适合这类细胞的转染,根据目前文献支持,Cas9 RNP体系用于电转具有更高的基因编辑效率,对于上述难转染的细胞推荐用riboEDIT™ CRISPR/Cas9 RNP体系,具体实验条件需要自行优化。

12.riboEDIT Cas9 mRNA 是否可以用于多个靶点或基因的编辑?

答:可以,通过混合多条crRNA与tracrRNA 和riboEDT Cas9 mRNA 共转染,可实现对多个靶点或基因的编辑,最佳共转染体系需自行优化,请保证crRNA 和tracrRNA 按1:1 加入。

13.mRNA 转染与DNA 转染相比,有哪些优势?

答:(1)DNA 转染需要进入细胞核,对于快速分裂的细胞才能达到理想的转染效果,而mRNA 转染只需进入细胞质,可大大提高有丝分裂后细胞或缓慢分裂细胞的转染效率。(2)没有转录过程,蛋白表达更快速,缩短实验周期。(3) 更加安全,无DNA 整合风险。

14.如何用riboFECT™ mRNA Transfection Reagent 转染Cas9 mRNA 和sgRNA 进行基因编辑?

答:riboFECT™ mRNA Transfection Reagent 适用于转染mRNA、 lncRNA、CRISPR sgRNA 或crRNA/tracrRNA、siRNA、miRNA、小于1kb 的双链DNA 或HDR 模板。尤其适用于Cas9 mRNA 和crRNA/tracrRNA 共转染进行基因编辑, 转染步骤请参照《riboEDIT™ CRISPR-Cas9 体系使用说明》实验方法部分riboEDIT™ CRISPR/Cas9 mRNA 操作说明。当利用CRISPR 做基因敲入,需自行优化Cas9 mRNA、crRNA/tracrRNA 及HDR 模板共转染体系,以获得最佳效果。

15.转染过程中,细胞培养基内能否含有血清及双抗?

答:riboFECT™ mRNA Transfection Reagent 是一款低毒、高效的转染试剂,血清的存在会影响转染复合物的形成,请确保在孵育转染复合物时使用的是无血清培养基。孵育结束后,转染复合物可直接加入含有或不含有血清/双抗的细胞培养基中,无需更换培养基,操作简便。

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产品编号 产品名称目录价数量操作
C11062-1 riboFECT mRNA Transfection Control(EGFP),500ng/μL, 10ug¥1,200.00
C11057-2 riboEDIT Cas9 mRNA (0.5ug/ul), 40ug¥5,420.00
C11057-3 riboEDIT Cas9 mRNA (0.5ug/ul), 100ug¥11,000.00
crG00001 riboEDIT CRISPR-Cas9 mRNA Guarantee Set, 20T(基因编辑效率保证套装)¥15,990.00 - 开始定制
crS00001 riboEDIT CRISPR-Cas9 mRNA Standard Set, 20T(基因编辑标准套装)¥11,990.00 - 开始定制
CR-NRA-1 riboEDIT Designed crRNA(设计合成crRNA)询价 - 开始定制
crRP0001VS riboEDIT Positive Control crRNA Validation Set for Human (验证用阳性对照crRNA及正反引物)¥1,000.00
crT00001-5 riboEDIT tracrRNA, 5nmol¥628.00
crT00001-20 riboEDIT tracrRNA, 20nmol¥1,380.00
C11055-1 riboFECT mRNA Transfection Reagent, 75ul¥800.00
C11057-1 riboEDIT Cas9 mRNA (0.5ug/ul), 20ug¥2,950.00
C11053-1 riboEDIT Cas9 Protein, S.pyogenes(20uM), 500pmol¥1,260.00
C11054-1 riboEDIT T7EI Enzyme (10U/ul),100U¥880.00
人源和小鼠设计合成crRNA每条的价格:1250元/5nmol, 1650元/10nmol,大规格定制请在线询价,提供crRNA序列设计服务。
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主要参考文献

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[4]Vakulskas CA, et al.A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells[J]. Nature Medicine,2018,(8):1216-1224.

[5]Martin RM, et al.Highly Efficient and Marker-free Genome Editing of Human Pluripotent Stem Cells by CRISPR-Cas9 RNP and AAV6 Donor-Mediated Homologous Recombination[J].Cell Stem Cell,2019,24(5):821-828

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