A：依不同的转染方法或转染试剂而定。如使用riboFECT™ CP Reagent转染siRNA，细胞密度达到30%~50%最佳。主要的控制目标为检测时细胞不要完全长满，若实验细胞对转染的毒性反应比较明显，则可以提高转染时的细胞密度以减少转染毒性对细胞的影响。

A：Bulge-Loop miRNA qRT-PCR及miDETECT A Track miRNA qRT-PCR的相关引物序列均为保密信息，不提供或公开。

A: 需要。在混合多个crRNA之前，配置crRNA:tracrRNA:Cas9核糖核蛋白复合物有助于抑制不同crRNA之间不必要的相互作用，从而保证与tracrRNA正确杂交。

A: 因为crRNA可以识别并结合与PAM位点NGG序列相反的基因组DNA链上的19-20个核苷酸，crRNA原型间隔子序列应包括从左往右PAM位点上游的19-20 nt。由于crRNA识别并结合了与PAM位点NGG序列相反的DNA链上的20个碱基，因此通过输入PAM位点上游的20个碱基来对crRNA进行排序。如果通过在线设计工具粘贴CRISPR目标位点，请确保正确的链取向。

A: 为避免重复使用细胞内技术带来的问题，建议使用无细胞方法（Circle-seq测序或site-seq测序）初步筛选脱靶效应。Guide-seq也是一种可以考虑的无偏差活细胞方法。基于生物信息学预测脱靶位点的方法并不够全面。

A: 按照参考人类基因组GG= 5.21％的频率，预计人类基因组中有161,284,793个NGG PAM位点，即每42个碱基大约有一个GG二核苷酸。

A: 可能存在以下两种情况：

使用转染试剂的情况下：

转染试剂可能具有细胞毒性，并且细胞死亡的程度可能因为细胞类型而存在差异。如果细胞过度死亡，首先应该使用阳性对照crRNA优化转染反应，该RNA可用于人、小鼠和大鼠细胞。这种操作的目标是使用最少量的脂质转染试剂，并且不会显著影响转染效率。您可以尝试使用其他转染试剂，因为化学上的微小差异会影响毒性。确保寻找针对RNA优化的转染试剂，以转染CRISPR-Cas9 RNA和RNP。

进行电穿孔的情况下：

最佳电穿孔条件随细胞系以及引入细胞中物质（质粒、RNA、DNA或核糖核蛋白）的类型、数量和规模而变化。可以优化的电穿孔条件包括细胞数量、引入物质的相对量、电压、脉冲宽度和脉冲数。

A: 靶基因可能对细胞至关重要，因此敲除后会造成细胞死亡。如果阳性对照crRNA起作用，并且靶标被成功敲除，说明该基因很重要。

A:    1) 仔细检查crRNA序列是否符合预期的物种和靶点位置。例如，验证细胞中的靶点没有显示任何可能影响crRNA效力的多态性。
2) 确认可以使用已知的阳性对照guide RNA（例如用于人类、小鼠或大鼠的阳性对照crRNA）观察到成功的编辑。
3) 如果阳性对照组有效，但实验组crRNA无效，建议测试附近靶点以确定是否可以找到更有效的guide RNA。

A: 不能。已表征的CRISPR-Cas9复合物不能识别缺乏PAM序列的靶标或识别能力极差。但是，如果序列中不存在化脓性链球菌CRISPR系统中发现的NGG序列，则来自其他细菌物种的CRISPR系统可能会起作用，这些细菌可以识别非标准PAM序列。 例如，嗜热链球菌的PAM序列是NNAGAA和NGGNG，脑膜炎奈瑟氏球菌的PAM序列是NNNNGATT。

A: 很难说。由于人类基因组中双核苷酸“GG”的频率为5.21％，因此基本可以预计大多数基因都含有化脓性链球菌PAM的NGG序列。

A: 不是。PAM序列位于非互补链，即它位于包含与靶标crRNA相同DNA序列的DNA链上。 PAM序列不应包含在crRNA的设计中。源自化脓性链球菌的最常用的Cas9核酸酶可以识别NGG的PAM序列，该序列位于非靶链上基因组DNA中靶序列的直接下游。

A: 评估方法可能会导致编辑效率过低。错配核酸内切酶（例如T7EI）无法检测到单个碱基的变化，而且与直接测序相比会低估实际编辑效率。并非与PAM位点相关的每个序列都会发生相同的情况。例如，原间隔物结合位点的多态性可能会降低编辑效率。离PAM位点越近，碱基错配越不利于编辑。建议在目的基因中尝试2个或3个不同的PAM位点，以确定实现最佳编辑效率的位点。另外，利用对照实验监测或优化CRISPR试剂的递送。

A: 细胞中的内源性DNA修复机制修复Cas9产生的双链断裂的方式是随机的，可能会改变CRISPR编辑分析中引物结合位点的DNA碱基。建议重新设计引物，使引物远离Cas9裂解位点。

A: 如果目的区域太小以至于没有“GG”基序，则需要探索可以识别不同PAM位点的（来自其他有机体的）Cas9核酸内切酶。同时，研究也显示化脓链球菌Cas9可以识别NAG，只是效率较低[Jiang et al. (2013). RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nat Biotech, 31:233–239.]。

A: 在大多数真核细胞中，非同源末端连接（NHEJ）途径在双链断裂（DSB）修复过程中会产生插入和缺失。但是，在存在与DSB侧翼序列具有同源性的DNA模板的情况下，同源性定向修复（HDR）可以准确地密封DSB。在大多数细胞中，这两种修复途径均具有活性，但是在缺少同源模板的情况下，HDR的效率通常低于NHEJ。该模板自然存在于S期晚期和G2期的姊妹染色质中，也可以人工添加为供体DNA。

HDR效率取决于修复时供体DNA的浓度、供体DNA同源臂的长度、细胞周期以及内源性修复系统的活性。这些因素可以保证在不同细胞系中观察到的HDR效率的高度可变性，尤其是在永生细胞中。确定细胞系的最佳HDR条件非常重要。

A: 可以。锁核酸可以作为DNA和RNA寡核苷酸使用，我们提供定制合成锁核酸碱基序列。如果要在序列中包含锁核酸修饰碱基，只需在碱基的前面增加“+”，例如：+ A + C + G + T。

A: 对于长期储存的寡核苷酸来说，温度是最重要的因素。长期储存时，无论寡核苷酸是干燥的还是重悬于未经DEPC处理的水或TE缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，0.1 mM EDTA）中，–20°C~-80℃冷藏是最佳的储存方式，可以稳定保存至少1年。

A: 建议在5’末端对引物进行生物素化处理，以避免干扰新生链的延伸。只要将生物素正确放置在5’末端，修饰就不会影响引物的特性。生物素化的引物可以用于未经修饰的寡核苷酸相同的反应条件。如果反应效果不理想，改善Mg2 +和/或退火温度可能会保证更有效的扩增。

A: 在大多数情况下，标记探针应与其他定制的寡核苷酸序列一样处理。建议将探针重悬在TE缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，0.1 mM EDTA）中；可以使用未经DEPC处理的无核酸酶水（尽管对保存期限有一定限制）。理想情况下，对于每个重悬的探针都要单独存储并制作几个等分试样，并将其全部存储在–20°C环境下。对于长期存储的寡核苷酸，温度是最重要的因素。长期存储时，无论是将寡核苷酸干燥，还是将其重悬于水（未经DEPC处理）或TE缓冲液中，最好冷冻保存。

对于室温或4°C的储存环境，重悬在TE缓冲液中的寡核苷酸比干燥的寡核苷酸更稳定；储存在水中的寡核苷酸最不稳定。在4°C的环境中，所有条件下储存的寡核苷酸都可以稳定至少60周。

A: 尽管大部分产物都是所需序列，但标准脱盐寡核苷酸也会包含异质序列，并且这种异质性会随着寡核苷酸长度的增加而增加。寡核苷酸是通过一系列化学反应由3′端向5′端、每次产生一个碱基而最终实现合成的。化学反应不可能100％有效；偶联反应本身的效率约为99％。因此，每次添加碱基后，大约1％的寡核苷酸链将不会进行碱基延伸。碱基偶联后，加帽步骤可以防止截短的分子参与进一步的碱基添加。由于加帽反应的效率无法达到100％，截短的突变体中只有一小部分会保持未加帽并在后续的偶联步骤中反应，从而导致缺失突变的形成。所得寡核苷酸制品虽然主要由订购提交的目标序列组成，但同时也包括全长寡核苷酸、截短序列和具有内部缺失的序列。

A: 将Cy标记的寡核苷酸加热至94⁰C并不会引起Cy染料的降解或损失。Cy标记的寡核苷酸常用于PCR相关应用，不会出现问题。但是，Cy染料非常容易受到臭氧的破坏，还存在一些自猝灭问题（参见Gruber et al (2000) Bioconjugate Chem 11:696-704.）。存储时，建议将Cy标记的寡核苷酸保存在-20℃的中性pH溶液中。

A: 在室温下可以退火寡核苷酸，通过加热的方法使寡核苷酸变性，然后缓慢冷却以退火两条寡核苷酸可以确保更有效的退火，并有利于最稳定的双链体形成；如果选择不加热寡核苷酸，则应谨慎筛选寡核苷酸的二级结构，因为该结构可能会影响退火反应。

退火操作规范：以高浓度（100 µM-500 µM）介质溶解寡核苷酸，例如：1-10 OD260单位/ 100 µL 的STE缓冲液（10 mM Tris pH 8.0、50 mM NaCl，1 mM EDTA）或无核酸酶的双重缓冲液（30 mM Hepes pH 7.5，100 mM KAc）。盐对于寡核苷酸杂交是必需的。将两条寡核苷酸以等摩尔浓度混合，加热至94°C，并使溶液缓慢冷却至室温。对于具有重要发夹结构的序列，冷却过程越平缓越有利，将寡核苷酸放入水恒温槽或微量恒温仪中，然后拔下电源插头，即可轻松实现。所得产物将是稳定的双链构建体。

A: 是。您可以设计具有所需突出端的寡核苷酸，并将其直接连接到酶切载体中。如果订购的寡核苷酸具有所需的突出端，则可能需要在连接到酶切载体之前为退火的寡核苷酸添加5’磷酸化修饰，以提高连接效率。您可以订购经过修饰的寡核苷酸，或在收到寡核苷酸后对其进行磷酸化反应。用限制酶切割载体时，限制酶将在载体突出端上留下5’磷酸化，使寡核苷酸突出端可以连接到载体中。

A: 合成的DNA和RNA具有5’和3’OH基团。 如果实验需要5’磷酸基团（例如连接反应），则需要在序列中增加磷酸化修饰。5’磷酸化的修饰为/ 5Phos /，合成时就会将磷酸化修饰加入到5’端的序列中。

A: 光线破坏寡核苷酸的主要原因是自然光中的紫外线辐射。当暴露在人造光线下时，荧光标记的寡核苷酸相当稳定。在实验室正常使用期间，无需使用棕色试管和/或箔纸覆盖物保护荧光标记的寡核苷酸免受人造光源的伤害。

A: 强烈建议将荧光标记的寡核苷酸重悬并储存在-20°C的缓冲溶液中，例如TE（10 mM Tris pH 8.0，0.1 mM EDTA），这样有助于延长染料标记的寡核苷酸的保质期。另外，配制冷冻原液（100 µM）和几个等分试样可以避免不必要的反复冻融。

A: 对于当前测试的修饰，修饰寡核苷酸的降解模式与标准寡核苷酸相似，即：为了获得最佳稳定性，需要长期保存的寡核苷酸应该在–20°C环境下冷藏。如果需要重悬， TE缓冲液保存（10 mM Tris，0.1 mM EDTA，pH 7.5–8.0）比直接用水保存（未经DEPC处理）更好。-20°C环境下，所用存储介质类型的影响很小，但在较高温度下存储介质的影响就会更加明显。另外，将寡核苷酸储存在黑暗环境中是理想的操作，还应该避免暴露在紫外线下、尽量减少实验室环境光，某些修饰的寡核苷酸尤其如此。

A: 不会，在寡核苷酸上添加硫代磷酸酯键并不会干扰退火。

A: 标准脱盐寡核苷酸可用于常规PCR、qPCR和DNA测序应用。

A: 可以使用Speed-Vac浓缩样品以快速干燥寡核苷酸，或者利用乙醇（与盐一起）沉淀寡核苷酸。需要注意的是，乙醇沉淀可能会导致产物损失。

A: 杂交的寡核苷酸或DNA双链体可以通过适当分子量标记进行非变性凝胶电泳。或者，将双链寡核苷酸与单链寡核苷酸并排运行。如果退火成功，双链条带将从单链条带上移。使用紫外线或使用SYBR®Gold等染色使条带可视化。溴化乙锭可能无法充分染色单链DNA以使其可见。

A: 5’磷酸化的引物不会影响PCR，因为引物延伸发生在3’末端。扩增子每条链上的5’磷酸化对于将PCR产物连接到载体中是必需的。

A: 一价和二价盐（如Na +、Mg2 +）通过屏蔽带负电荷的DNA序列主链保证双链体形成的稳定性，从而使两条链更加靠近。较高的阳离子浓度也可以保证更稳定的双链体形成。

A: 向寡核苷酸添加新的碱基分为四步：1）从5’氧中去除三苯甲基，2）将两个碱基偶联在一起，3）将磷酸氧化以稳定两个碱基的连接；和4）将任何不参与偶联反应的寡核苷酸加帽（以阻止后续碱基的添加）。

具有完整磷酸二酯主链的正常寡核苷酸和具有部分或完整硫代磷酸硫酯主链的寡核苷酸的合成差异在于步骤（3）中氧化剂的选择。磷酸二酯键磷酸盐是通过使用碘和水添加4’氧生成的，硫代磷酸酯键是通过使用Beaucage试剂将硫醚添加到磷酸酯中产生的。一旦将硫醚或氧连接到磷酸盐上，合成就会稳定，并且不会受到后续化学循环的影响。通过循环使用两种氧化剂，嵌合骨架即可以成功构建。

A: 大多数修饰的寡核苷酸可以像未修饰的寡核苷酸一样存储和重悬。对于长期存储，温度是要考虑的最重要因素。长期储存时，无论是将寡核苷酸干燥，还是将其重悬于水（未经DEPC处理）或TE缓冲液中，最好冷冻保存于-20 ℃环境中。对于室温或4°C的储存环境，重悬在TE缓冲液中的寡核苷酸比干燥的寡核苷酸更稳定；储存在水中的寡核苷酸最不稳定。在4°C的环境中，所有条件下储存的寡核苷酸都可以稳定至少60周。

另外，将寡核苷酸储存在黑暗环境中是理想的操作，还应该避免暴露在紫外线下、尽量减少实验室环境光，某些修饰的寡核苷酸尤其如此。

对于重悬，建议先制备储备溶液，然后再将工作等分试样细分，以避免污染整个储备环境；同时，限制重复冷冻/解冻循环的次数以防止寡核苷酸降解。特定修饰的注意事项：含有光可裂解或光不稳定修饰的寡核苷酸应该远离光线，因此应使用琥珀色试管运输。建议存放在暗管中或用箔纸包裹。

A: 包装寡核苷酸的塑料管底部有时会显得浑浊。为了确定寡核苷酸是否已完全溶解，可以在重悬液上读取OD260读数。在寡核苷酸完全溶解的情况下，如果读数低于预期，建议将寡核苷酸加热至65°C 5-10分钟，然后涡旋振荡几秒钟。一些修饰和序列可能会造成寡核苷酸难以溶解。

A: 大多数寡核苷酸是透明无色的，通常只能在试管中看到些许薄膜或残留物。由于运输可能会使透明的沉淀物脱落，因此在打开试管并重悬寡核苷酸时务必小心。建议在微量离心机中短暂旋转离心管，使沉淀物落入离心管底部。在重悬过程中，可以将重悬介质吸移到试管侧壁以获取所有的寡核苷酸沉淀物。

A: 不可以。不建议将寡核苷酸重悬或存储在DEPC处理过的水中。经DEPC处理的水可能是酸性的，会导致寡核苷酸的脱嘌呤作用，从而导致降解。为了获得最佳稳定性，需要长期保存的寡核苷酸应该在–20°C环境下冷藏。如果需要重悬， TE缓冲液保存（10 mM Tris，0.1 mM EDTA，pH 7.5–8.0）比直接用水保存（未经DEPC处理）更好。-20°C环境下，所用存储介质类型的影响很小，但在较高温度下介质类型的影响就会更加明显。将寡核苷酸储存在黑暗环境中是理想的操作，还应该避免暴露在紫外线下、尽量减少实验室环境光，某些修饰的寡核苷酸尤其如此。另外，建议通过准备冷冻储存原液（100 µM）和几个等分试样避免不必要的反复冻融。

A: 有几种修饰方法可以阻止3’延伸。大多数3’修饰都可以阻止PCR延伸,其中最常用的修饰是3’ddC、3’Inverted dT、3’C3间隔基、3’氨基和3’磷酸化。

A: 荧光标记的寡核苷酸的稳定性和荧光功能类似于标准寡核苷酸的稳定性。为了获得最佳稳定性，需要长期保存的寡核苷酸应该在–20°C环境下冷藏。如果需要重悬， TE缓冲液保存（10 mM Tris，0.1 mM EDTA，pH 7.5–8.0）比直接用水保存（未经DEPC处理）更好。-20°C环境下，所用存储介质类型的影响很小，但在较高温度下存储介质的影响就会更加明显。

需要注意的是，暴露于自然光或臭氧不利于荧光基团的稳定性。

A: 是否需要订购纯化寡核苷酸因研究需求而异。纯化涉及合成总产物的馏分收集，降低寡核苷酸的变异性，可能会使随机碱基比率产生偏差，从而导致总体随机性降低。鉴于这一点，纯化在某些情况下仍有必要，尤其是使用非常长或高度修饰的寡核苷酸时。

A: 建议在打开干燥寡核苷酸试管之前先对其进行短暂离心，确保寡核苷酸沉淀物位于试管底部，并且在打开盖子时不会丢失。加入未经DEPC处理的水或缓冲液（例如TE）之后，短暂涡旋试管，但不要离心。

A: 固有的化学结构决定了RNA不如DNA稳定。降解RNA的RNA酶也比DNase更普遍。由于与DNA相比，RNA对降解更敏感，因此建议使用含有螯合剂的中性至弱酸性缓冲液短期存储RNA。但是，RNA在-80°C环境下作为乙醇沉淀物存储时最稳定，长期存储尤其如此。 RNA寡核苷酸存储的关键是避免使用RNase。

A: 适配体是通过3维结构以极高的亲和力和特异性结合至特定靶分子的RNA或DNA寡核苷酸（或肽）。适配体通常使用SELEX技术（指数富集的配体系统进化技术）等进行鉴别，经过几轮筛选之后，对靶分子具有更高亲和力和特异性的寡核苷酸会从序列库中被分离出来。这些分子可以替代用于识别特定靶标的抗体，具有与针对其靶标的抗体相似的亲和力，同时稳定性更高、更易于大规模生产、免疫原性低以及可以以低抗原性靶向分子。与抗体一样，适配体具有广泛的应用范围，可以用作药物、诊断和治疗工具、分析试剂和生物成像分子。在体外和体内使用时，序列可以通过修饰增强稳定性。

A: DNA / RNA杂交最常用于RNA沉默，其中DNA碱基置于siRNA分子的末端可以减少细胞内的降解。其他适用范围包括RNase H的基因分型和SNP检测。

A: RNA嵌合体是既包含RNA又包含DNA或2’氧甲基碱基的寡核苷酸，例如ASO。

A: 荧光标记的寡核苷酸的稳定性和荧光功能类似于标准寡核苷酸的稳定性。为了获得最佳稳定性，需要长期保存的寡核苷酸应该在–20°C环境下冷藏。如果需要重悬， TE缓冲液保存（10 mM Tris，0.1 mM EDTA，pH 7.5–8.0）比直接用水保存（未经DEPC处理）更好。-20°C环境下，所用存储介质类型的影响很小，但在较高温度下存储介质的影响就会更加明显。

需要注意的是，暴露于自然光或臭氧不利于荧光基团的稳定性。如果荧光修饰的寡核苷酸需要暴露在持续的光线下，则应考虑使用光源保护罩（例如棕色试管和/或箔纸）。

A: 由于其化学结构，RNA本质上不如DNA稳定。 另外，RNase在标准实验室条件下比DNase更为普遍。

A: 有时需要利用单链寡核苷酸制备双链DNA。尽管退火过程很简单，但注意一些细节可以大大减少不必要的单链材料。

操作方法：
将每个寡核苷酸溶解于高浓度（1-10 OD260单位/ 100μL）双重缓冲液（100 mM乙酸钾，30 mM HEPES，pH 7.5）中。适量的盐对于寡核苷酸杂交是必需的；
将等摩尔量的两个序列混合在一起。如果使用不同的量，则会剩下某一个单链序列；
加热至94°C并逐渐冷却至室温。对于具有重要发夹结构的序列，冷却/退火过程越平缓越有利。将寡核苷酸放入水恒温槽或微量恒温仪中，然后拔下电源插头，即可轻松实现；
所得产物为稳定的双链形式，可以在4°C保存或冷冻。

温馨提示：
如果产物用于连接反应，则可能需要添加5′-磷酸盐，在寡核苷酸合成（化学磷酸化）时或在此之后随时使用PNK（酶促磷酸化）操作即可。如果寡核苷酸相对较长或需要用于克隆，建议从PAGE纯化的寡核苷酸开始。

A: 引物中使用了混合碱基，以结合在引物结合位点包含变异性或混合序列的模板。混合碱基也可用于在克隆文库和定点诱变中创造多样性。

A: HPLC纯化有助于去除截短的合成产物并提高纯度。对于长度大于40个碱基的寡核苷酸和多种修饰的寡核苷酸，建议进行纯化。另外，由于其合成的化学性质，许多修饰需要HPLC纯化。HPLC纯化通常可以保证约85％的纯度。只要序列不被过分修饰或不包含明显的二级结构，就可以为不超过60个碱基的序列提供纯度保证。通常，HPLC产生的寡核苷酸纯度略低于PAGE，但保证产量更高。

A: 5’和3’Cy染料通过磷酸二酯键连接到核糖的羟基上；内部Cy染料通过其间存在染料的碱基的磷酸二酯键连接到主链上。

A: 在寡核苷酸的3’和5’末端放置硫代磷酸酯键的3-5个核苷酸可以抑制核酸外切酶降解；在整个寡核苷酸中引入硫代磷酸酯键也有助于减少核酸内切酶的影响。

A: 在定制化合成中，颜色变化是正常的。随着浓度的增加，变色的可能性更大。

A: 需要注意，“干燥”的寡核苷酸总会存在一定程度的水分，实际上不可能完全干燥。因此，长期保存时，重悬在TE缓冲液（10 mM Tris，0.1 mM EDTA，pH 7.5-8.0）中比干燥保存更稳定。但是，短时间运输时，干燥或在未经DEPC处理的水中储存的寡核苷酸非常稳定。

A: 在适当的条件下，荧光素染料（例如FAM）对于一系列操作都具有出色的信号强度，但是易受较高的光漂白速率影响，并且对酸性环境敏感，酸性环境会随着时间的流逝削弱信号。随着染料的质子化，信号将迅速降解，因此FAM标记的寡核苷酸应保存在pH值7.2或更高的溶液中以限制降解。为了最大程度地减少荧光素标记的寡核苷酸的光漂白，建议使用灵敏度较高的检测系统尽可能降低强度激发，同时配合宽带通滤光片使用。

A: 每一次合成都是唯一的，实际产量取决于序列组成、序列长度和纯化方法，同时也受到制造过程中的其他变量影响，例如化学批次、合成器等。

A: 处于干燥状态的寡核苷酸可以稳定保存数月，即使在延误的情况下，在运输过程中也不会发生过多的降解。但是，相比干燥的寡核苷酸，重悬的寡核苷酸相对较不稳定。干燥的寡核苷酸或在未经DEPC处理的水中储存的寡核苷酸在短时间内运输时是非常稳定的。

A: 将DNA储存于聚苯乙烯中时，寡核苷酸会由于被吸附到管壁中而损耗。建议使用聚丙烯管进行寡核苷酸存储，以最大程度地减少此类损失。