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动物体内实验常见问题

Q:不经过化学修饰的siRNA可否用于动物实验?
A:采用专门的转染试剂或特殊的给药方法,不经修饰的siRNA也可用于动物实验,但是动物实验对siRNA试剂在体内的稳定性和半衰期有较高的要求,通常推荐经特殊化学修饰或In vivo级别的试剂,以提高其稳定性和半衰期。
Q:选用哪一类化学修饰可以用于siRNA in vivo实验?
A:锐博生物提供多种化学修饰方式,常用的有2’OMe,FU/FC,PS等,您可以自行选择修饰方案,此外我们还提供动物实验专用的siRNA。
Q:修饰的siRNA在细胞水平的实验已经完成,是否可以用余下的siRNA做动物实验?
A:一般不建议用余下的siRNA试剂,因为动物实验体内条件更加复杂,一般需要采用专门的处理标准来合成siRNA,故应购买更可靠的动物实验专用siRNA。
Q:动物实验用的siRNA有Standard, in vivo;PAGE, in vivo;HPLC, in vivo,三者有什么区别,该如何选择?
A:三者均按照动物实验siRNA标准来处理或纯化,均可以用于动物体内实验。区别在于其纯度不同:Standard即全长RNA含量不低于80%;PAGE和HPLC即全长RNA含量不低于95%。试剂纯度越高,特异性和靶向性会更好,作用效果更加可靠,但成本也会更高。因此,如经费允许且要求高的条件下,建议选择更高纯度的siRNA进行实验。
Q:使用锐博生物动物实验用siRNA有发表过文章吗?是否可以提供参考?
A:有,请联系我司业务代表
Q:针对不同的器官如何给药?给药的推荐量是多大?给药频率是多少?
A:给药方法大致分为系统给药(如静脉给药、腹腔给药等)和局部给药(如皮下注射,玻璃体给药,鞘内给药等),一般需要根据不同的器官来选择,给药量也视不同的对象而异,主要是体重情况,如肝脏、肾脏常用静脉注射(系统给药);而皮下肿瘤则常用到瘤内注射(局部给药);系统给药每次注射5~20nmol/20g体重,局部给药则需每次注射1~5nmol/20g体重,给药频率往往是一周2~3次。
Q:进行小鼠的体内研究需要多少量的siRNA?
A:首先需要根据动物模型和实验方案,确定给药量和给药次数,然后计算出实验所需的总用量。系统给药每次注射5~20nmol/20g体重,局部给药则需每次注射1~5nmol/20g体重,给药频率往往是一周2~3次。
Q:miRNA agomir/antagomir针对不同的器官如何给药?给药的推荐量是多大?给药频率是多少?
A:给药方法大致分为系统给药(如静脉给药、腹腔给药等)和局部给药(如皮下注射,玻璃体给药,鞘内给药等)。给药方法的选择需要根据不同的器官来选择,而给药量因不同的给药量而异。如肝脏、肾脏常用静脉注射(系统给药);而皮下肿瘤则常用到瘤内注射(局部给药)。系统给药: agomir每次注射5~20nmol/20g体重, antagomir每次注射50~200nmol/20g体重;局部给药: agomir每次注射1~5nmol,antagomir每次注射5-20nmol。给药频率往往是一周2~3次。

细胞转染实验常见问题

Q:miRNA agomir/antagomir针对不同的器官如何给药?给药的推荐量是多大?给药频率是多少?
A:给药方法大致分为系统给药(如静脉给药、腹腔给药等)和局部给药(如皮下注射,玻璃体给药,鞘内给药等)。给药方法的选择需要根据不同的器官来选择,而给药量因不同的给药量而异。如肝脏、肾脏常用静脉注射(系统给药);而皮下肿瘤则常用到瘤内注射(局部给药)。系统给药: agomir每次注射5~20nmol/20g体重, antagomir每次注射50~200nmol/20g体重;局部给药: agomir每次注射1~5nmol,antagomir每次注射5-20nmol。给药频率往往是一周2~3次。
Q:如何选择转染方法和转染试剂?
A:转染方法和转染试剂的选择要根据不同细胞来选择,对于容易转染的细胞可以选择riboFECT CP转染试剂,对于mRNA/长链RNA转染、原代细胞或难转染的细胞,可以选择riboFECT mRNA转染试剂,对于高效的蛋白转染,可以选择riboFECT Protein转染试剂。 锐博生物提供从siRNA/miRNA、mRNA/长链RNA到蛋白质的全系列转染试剂,请根据下表确定适合您的转染试剂

siRNA/miRNA/质粒转染试剂,基因抑制效率高 mRNA/长链RNA转染试剂,适用于原代细胞 蛋白质转染试剂,可实现最高效转染
riboFECT™ CP转染试剂 riboFECT™ mRNA转染试剂 riboFECT™ Protein转染试剂
试剂规格 0.5ml, 1ml 0.5ml, 2.5ml 0.5ml, 2.5ml
样品类型 siRNA, miRNA mRNA, 长链RNA 蛋白质
转染效率 极佳 极佳 最高,可高达98%
细胞活力 极佳 极佳
细胞毒性 极佳 超低 几乎无细胞毒性
转染细胞系(部分) HeLa,A549,HEK293T,HCT-116,NIH/3T3,HepG2,HNE1,L6,5637,H-bc,HSC,C2C12,Sertoli,CNE-2,5-8F,HAEC,DRG,CF,THP-1,MEL,PBMC,NSC,MSC,U2OS human fibroblasts,CHO-K1,B16-F10,HEK293 HEK293,B16-F10,COS-7,COLO 205,dendritic cells (DC),H9c2,human fibroblasts (primary cells),HUVEC (primary cells),Jurkat,MC3T3-E1,MEF (primary cells),microglia,mouse podocytes (primary cells),NIH/3T3,SK-OV-3,U-373 MG
Q:对于难转染的细胞,应该如何提高其转染效率?转染效率又该如何确定?
A:1.对于贴壁细胞,推荐采用转染试剂转染即可; 2.对于难转染的细胞的转染,一般建议使用电转的方法,但是由于电转的方法对细胞损伤比较大,该方法也未必是最佳的,可以选用riboFECT mRNA转染试剂。 常采用荧光标记siRNA在荧光显微镜、共聚焦显微镜或流式细胞仪检测转染效率,具体请参产品说明书。
Q:细胞的转染效率是否与siRNA序列相关?
A:转染效率高低取决于细胞自身及转染方法,与siRNA序列无直接的关系。
Q:转染siRNA时细胞密度多少为宜?
A:依不同的转染方法或转染试剂而定。如使用riboFECT™ CP Reagent转染siRNA,细胞密度达到50%~80%最佳。
Q:转染时的培养基要求,可否含血清?
A:不同的转染试剂要求可能不同,对于riboFECT™ CP Reagent,在配制siRNA和riboFECT™ CP混合物时不能含有血清,但细胞培养基可以含有血清,但不能含有抗生素。
Q:siRNA储存液体浓度和工作浓度有何区别?
A:siRNA的贮存浓度就是保存的最佳浓度,锐博推荐的贮存液浓度为20 μM;而siRNA的工作浓度是使siRNA能够达到最佳沉默效果的转染浓度,一般10~100 nM范围内,锐博生物推荐的转染浓度是50nM。
Q:转染时该如何分组?分组的目的是什么?
A:
A组(必需)针对目的基因siRNA(重复三个孔)knockdown目的基因的表达
B组(必需)阴性对照siRNA(重复三个孔)用非特异的siRNA序列证明RNAi作用的序列特异性
C组(必需)转染试剂对照(重复三个孔)排除转染试剂对细胞的毒性或对目的基因表达的影响
D组(必需)空白对照(重复三个孔)用于检测实验过程中细胞的生长状态
E组(可选)阳性对照siRNA(重复三个孔)用于排除实验体系和实验操作的问题
F组(可选)荧光对照siRNA(重复三个孔)用于转染效率。当不明确细胞转染效率时,这一组为必需。
Q:用荧光对照siRNA如何检测转染效率?是不是每次实验都必须做?
A:我们提供的转染对照siRNA带有Cy3或Cy5荧光标记,可以通过荧光显微镜、共聚焦显微镜、流式细胞仪等荧光检测仪器检测。除此之外,还应该通过阳性对照实验进一步确定。转染效率的高低主要与细胞自身相关,同等实验条件下,每次转染效率应该是相近的,因此不必每次都做。但如果每次实验都做一个荧光对照组,将会更有利于排除一些实验问题。
Q:转染后出现细胞死亡是什么原因?如何优化转染条件?
A:如果是转染试剂对细胞的毒性,则可以减少转染试剂用量,或换用其他转染试剂或转染方法;如果细胞自身状态不好,则建议重新实验,必要时重新复苏细胞。
Q:到了转染时间发现细胞密度太低,该如时转染,还是让细胞多长一天再转染?
A:细胞生长需要一定的密度,而转染试剂对细胞有一定的毒性,如果转染时细胞密度过低,细胞可能会因此生长异常甚至死亡。转染前要求良好的细胞状态和细胞活性,一般也不建议用生长几天的细胞做转染。

阳性对照和阴性对照实验常见问题

Q:为什么说阳性对照在RNA干扰实验中很重要?
A:阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。也就是说,当您看到siRNA阳性对照的预期实验结果时,可确保您的实验方法中转染、RNA提取物和检测方法是可靠的。
Q:阳性对照及其阴性对照在RNAi实验中的作用?如何选择?
A:阳性对照指的是已经验证的针对看家基因或报告基因有效的siRNA,用于监测实验体系和实验方法的可行性。锐博生物提供针对GAPDH,ACTB,GFP/EGFP有效的siRNA作为阳性对照,您可以根据具体的实验需要选择。阴性对照往往是非特异的siRNA,主要用于说明siRNA作用的特异性,可以根据实验需要选择通用的序列(universal)或是随机打乱的序列(scramble)。
Q:各组阴性对照的检测结果是否应该一样?如果偏差很大该怎么办?
A:正常情况下,各组阴性对照的检测结果应该是相近的。如果偏差过大,只需考虑实验结果的准确性。另外,对于一些特定的基因,比如与细胞难受压力相关的基因,又如参与细胞免疫的基因,可能会对外界压力比较敏感,使得各组对照的基因表达发生变化不一致。

RNAi实验常见问题

Q:siRNA荧光染料的最大吸收率和发射率各在哪个波段?
A:FAM在495nm处有最大吸收率,在520nm处有最大发射率。 Cy3在550nm处有最大吸收率,在565nm处有最大发射率。 Cy5在643nm处有最大吸收率,在667nm处有最大发射率。
Q:siRNA作用效果应该如何检测?
A:通常可以从三个方面来相互验证siRNA的作用效果 1) 用Realtime RT-PCR方法,从mRNA水平检测: 2) 用Western blot,ELISA等方法,从蛋白水平检测; 3)用高内涵显微镜,根据目的基因的功能,从细胞表型水平检测。
Q:siRNA在细胞内可以作用多长时间?什么时候才是最好的检测时间?
A:siRNA介导的RNAi属于瞬时现象,不能稳定传代,一般其作用时间不可能维持很长时间,通常建议在转染后3~4天内完成检测。最佳检测时间,因细胞、目的基因而异,多在转染后24~48小时之间检测。
Q:为什么要强调mRNA水平检测?可以直接检测蛋白和功能吗?
A:siRNA直接作用于mRNA,因此mRNA水平检测是最直接在指标。 很多客户认为,mRNA降解的直接结果应该是对应蛋白质含量的下降,因此蛋白水平的检测结果也应该可以作为有效性的检测指标。事实上,很多情况下会出现mRNA下降水平与蛋白下降水平不对应的现象。其可能原因有: 1) 与选择的检测时间有关。可能因mRNA的下降尚未反映在蛋白量的变化上或者未达到足以检测的水平,所以一般建议蛋白和功能检测时间要稍稍推后。 2) 与蛋白在细胞中的表达情况有关。mRNA的翻译过程非常复杂,细胞内基因的表达总要维持一个平衡,某些蛋白表达量到一定的程度之后,足以维持其细胞功能,将可能暂时“关闭”表达的功能,转录出来的部分mRNA可能不参与蛋白翻译的过程,故mRNA水平下调与蛋白水平下调并非完全成正相关的关系。 3) 可能还会涉及到更加复杂的机制。
Q:干扰效率多高才是好的靶点?
A:没有明确的界定,干扰效率高低因不同的细胞类型和不同的基因而异。不同细胞类型的转染效率也不尽相同,不同基因的表达水平也相差较大,主要看干扰效果而定。
Q:沉默效果不理想,应该如何处理?
A:最常见的影响沉默效果的两个原因:转染效率低和siRNA序列设计的效果不理想。如果您初次使用siRNA或采用了新的细胞系,并发现沉默效果不佳,我们建议您对转染效率进行检测,并选择优化转染条件。如果您已经对实验转染条件进行优化但是问题依然存在,我们建议您换用另一种转染试剂或是采用其他技术,这也许能提高转染效率。如果已经提高了转染效率但是沉默效果仍然未达到要求,可能是因为siRNA序列设计的效果不理想。
Q:siRNA使得目的基因表达上调了,这是什么原因?该怎么解决?
A:可能的原因: 1.由于转染浓度过高或转染条件不合适,导致基因表达异常,可尝试优化转染条件; 2.与细胞类型相关,可能某些细胞对外界刺激比较敏感,可尝试换用其他细胞; 3.检测结果不准确,优化检测条件(RNA质量、引物设计、反应条件等)
Q:我从阴性对照实验中得到和特异性RNAi相同的结果,这说明了什么?
A:可能的原因: 1.非特异性作用的结果:由于转染浓度过高或转染条件不合适,导致基因表达异常,可尝试优化转染条件; 2.所选用的阴性对照siRNA序列发生了不预期的off-target作用,对目的基因也发生干扰作用,尝试换用其他的阴性对照siRNA。
Q:用100nM 的siRNA转染时只得到50%沉默效率,可否把siRNA的浓度增加到200nM甚至400nM?
A:当干扰效率不佳时,可以在一定范围内适当优化转染浓度,通常优化的范围是10~150nM,但不宜过大,高浓度的siRNA将可能增加非特异性作用的可能性并对细胞产生毒性。
Q:同样的siRNA,为什么在细胞A很有效,在细胞B则没有效果?
A:不同细胞的转染效率不一样、基因表达水平也不一样,这些都与siRNA的作用效率有关。
Q:siRNA该如何设计?
A:我们有自主开发的在线的设计软件siCatchTM siRNA design tool。客户提供基因名称或基因ID,锐博生物可以提供免费设计的服务。
Q:siRNA的末端悬垂是必须的吗?该如何选择?
A:传统的siRNA结构是19 mer + 2’悬垂的结构,目前也有一些siRNA是顿末端的。悬垂的选择上,dTdT/UU是最常见的,另外也有以dNdN(N代表与基因序列对应的碱基)作为悬垂的。悬垂的选择对于siRNA的作用效率并没有很大影响。
Q:如果知道某一基因产物的蛋白序列,可以设计一条靶向这个蛋白的siRNA吗?
A:siRNA的作用是在RNA水平,而不是在蛋白质水平。要设计siRNA,必须准确知道靶mRNA序列。由于遗传密码的兼并性和密码子的偏移,不可能通过蛋白序列准确预测核苷酸序列。转录后的RNA前体通过剪接去除内含子序列形成成熟的mRNA。因为siRNA的功能是酶解mRNA序列的,根据基因组序列设计的RNA序列有可能落在内含子区,导致设计的siRNA无效,所以应该根据mRNA序列而不是基因组序列来设计siRNA。
Q:为什么在已公布的siRNA序列中5’端部分有AA结构?这一结构是否是必须的?
A:过去“AA”代表siRNA靶序列的起始端,研究者常将它们作为序列组成的一部分,但它们却不是作为合成siRNA序列的一部分。siRNA靶序列往往写成“AA-(N19)”的格式,其中“AA”用于提示3’端悬垂为dTdT 或UU。N19靶序列和两个悬垂组合形成一个21-mer的双链。这一结构并不是siRNA设计的必需要求。
Q:针对人体基因设计的siRNA对其他物种是否也有效?
A:尽管不同物种的基因是同源基因,但是这些同源基因的表达序列都存在或多或少的差别,而siRNA要求序列特异性,即完全互补配对,故大部分siRNA无法满足多物种基因沉默的效果。即便是针对不同物种的同源基因的相同片段,由于基因表达差异,也不能保证其在不同物种中的基因沉默效果。
Q:siRNA是否可以做修饰或标记,该如何选择?
A:可以对siRNA做修饰或标记,我们可供选择的修饰或标记见化学修饰siRNA部分。为避免修饰或标记后对siRNA作用效率的影响,修饰或标记多选择在正义链(需根据具体的实验要求而定)。
Q:化学合成的siRNA靶点序列是否可以用于构建shRNA真核表达质粒载体?
A:可以,但不同shRNA表达载体对序列还有特定的要求,因此必须考虑表达载体的具体要求来确定可行性。
Q:化学合成方法筛选出有效的序列构建到shRNA表达载体之后是否会同样有效?
A:理应有效,但由于载体表达相对比较复杂,其有效性涉及到载体是否能否在细胞内强表达、是否可以被正确加工等问题,因此不排除出现shRNA不工作的情况。
Q:shRNA表达载体的方法有效的序列用化学合成的方法来做是否会同样有效?
A:shRNA表达载体的方法容易出现“假阳性”,不排除出现siRNA不工作的情况。
Q:siRNA是否需要低温运输?
A:我们的siRNA以冻干粉的形式供货,可以在常温下运输。收到产品后应在-20~-80℃条件下保存。
Q:shRNA表达载体的方法有效的序列用化学合成的方法来做是否会同样有效?
A:shRNA表达载体的方法容易出现“假阳性”,不排除出现siRNA不工作的情况。
Q:由于快递的原因将近一周才收到siRNA,室温条件下放置这样长时间,siRNA会降解吗?
A:冻干粉形式的siRNA在常温下可以稳定存在1-2周。
Q:shRNA表达载体的方法有效的序列用化学合成的方法来做是否会同样有效?
A:shRNA表达载体的方法容易出现“假阳性”,不排除出现siRNA不工作的情况。
Q:siRNA应该如何溶解,如何保存?
A:开盖之前请短暂离心,加入灭菌的RNase-free H2O或者灭菌的ddH2O,配制成20μM贮存液,适当分装并于-20℃-80℃条件下保存。
Q:我需要配置浓度为20uM的储存液,如何计算重悬siRNA缓冲液的量?
A:锐博生物为您提供的siRNA是以nmol为单位的冻干粉。样品浓度的计算如下:(siRNA的量,nmol)/(重悬体积,uL)=样品浓度,umol/L。例如:您购买了5nmol的siRNA,想溶解为20uM的样品,应该使用250uL缓冲液溶解,配置为20uM的样品。具体的溶解体积可以参见下表: 表1 20μM储存液的配置参考
siRNA(nmol)0.250.512520
溶解体积(μl)12.525501002501000
Q:siRNA溶解后保存在-20℃,反复使用多次,会影响siRNA的质量?
A:我们建议溶解后分装保存,一般不建议溶液形式的siRNA反复冻融超过5次。
Q:siRNA使用前是否需要先退火?
A:我们的siRNA已经完成退火,可以直接使用。
Q:转染miRNA mimic和inhibitor如何确定转染率?
A:最直接的方法为加设转染对照,直接观察转染率。
Q:miRNA mimic和inhibitor转染时的浓度是否一样?
A:由于miRNA inhibitor其竞争抑制性的作用机制,其往往需要较大的用量才能观察到预期的抑制效果,则相当于mimic的几倍用量。推荐的mimics转染浓度为50nM,inhibitor转染浓度为100nM。
Q:多个miRNA的共转染怎么做?
A:根据每个miRNA的转染浓度取量,按照常规的方法转染即可。
Q:miRNA mimic实验结果不能重复?
A:可能与miRNA表达及作用的时空特异性相关
Q:miRNA inhibitor及其miRNA antagomir的区别是什么?该如何选择?
A:miRNA inhibitor和antagomir都用于抑制miRNA的功能研究,二者的区别也主要在修饰方式上。细胞实验可以二者选择其一,而动物实验选择antagomir相对比较有优势。

qPCR实验常见问题

Q:miRNA qPCR实验的重复如何设置?
A:重复分为两类,一类是生物重复,一类是技术重复,生物重复是从处理样本后重新提取RNA开始,是几次完全独立的实验;技术重复可以在cDNA合成或者PCR反应的两个过程任选一步进行重复,主要看实验操作过程有无问题,一般选择在PCR时重复3次。
Q:5S qRT-PCR的产物有多大?
A:91bp,人、小鼠、大鼠的5S是同源的。
Q:U6 qRT-PCR的产物有多大?
A:94bp,人、小鼠、大鼠的U6是同源的。
Q:Bulge-Loop™ miRNA qRT-PCR的产物有多大?
A:80bp左右,不同miRNA的qRT-PCR的产物长度不尽相同,具体长度要依据实际引物长度而定。
Q:NTC 有扩增 ?
A:可能原因: 1) 试剂污染;2) 引物二聚体 解决办法: 1) 更换试剂;2) 降低引物使用浓度 ;3) 调整程序设置,如提高退火温度,适当增加读板温度
Q:非特异性扩增有杂峰?
A:可能原因: 1) RNA被基因组DNA污染 2) 引物混杂有其他引物 3) 引物二聚体存在 解决办法: 1) 提取更高质量的RNA,并用DNaseI处理样本 2) 在冰上配制反应体系,降低非特异的起始扩增 3) 调整反应体系,如降低引物使用浓度,降低起始模板量 4) 调整程序设置,如提高退火温度,适当增加读板温度 5) 更换被污染的RNA模板、引物、酶等试剂
Q:qPCR产物量少该如何解决?
A:可能的原因: 1) RNA模板质量低或者cDNA模板质量低 2) 靶miRNA基因表达量低或者无表达,无法检测 3) 试剂中存在PCR抑制剂 4) PCR仪是否正常运转 5) PCR程序设置有无问题,如:循环数不够、无读板过程、无制作融解曲线的过程等 6) PCR过程所用试剂少加一种或多种,如,sybr、正反向引物、模板 7) PCR过程所用的酶、sybr等试剂有无失效等问题 8) 定量PCR引物的问题:如使用浓度太低、引物设计不好、引物合成序列有误等 解决办法: 1) 建议在试验中加入阳性对照RNA 2) 增加RNA和/或cDNA模板的量 3) 保证定量PCR仪运转正常 4) 调整程序设置,如增加循环次数,正常读板过程和溶解曲线制作过程 5) PCR反应所使用的酶一般为热启动聚合酶,预热过程需根据酶说明书设置 6) 保证PCR反应体系配制过程中无少加或漏加试剂,并且试剂均有效 7) 第一链的反应产物在进行PCR扩增时,在总的反应体系中的含量不要超过1/10
Q:cDNA产量低该如何解决?
A:可能的原因: 1) RNA模板质量低 2) 对mRNA浓度估计过高或浓度未测准确 3) 反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足 4) 反应体系少加试剂 5) 控温过程不正确,高温使反转录酶失效,低温达不到反转录酶的最佳反应效率 6) 反应体积过大,导致试剂被稀释 解决办法: 1) 重新提取高质量的RNA模板,并准确测定其浓度 2) 保证加入各种试剂建立完整的反应体系 3) 保证控温过程正确 4) 反转录反应体系不要超过50uL
Q:扩增曲线先正常上升,后来却下降,溶解曲线不规则,原因何在?
A:反应体系中存在酶抑制剂或者其他原因导致PCR酶失活或者染料降解,建议重提RNA模板,更换PCR试剂重新实验。
Q:转染了mimics或inhibitor后,可否用qPCR引物检测转染后miRNA量的变化,注意的问题有哪些?
A:我们的实验发现,对于转染效率比较高的细胞(如hela,A549等) ,一般转染mimics 50nM后与no-target相比高出约1万倍,转染表达miRNA的质粒后与空白对照质粒相比高出几百倍,inhibitor理论上与miRNA结合后阻止其与靶mRNA的结合,inhibitor并未导致miRNA的降解,因此qPCR可以检测mimics转染后miRNA表达的上升,无法检测inhibitor转染后miRNA表达的下降,当然如果某些inhibitor确实通过未知途径导致miRNA的降解也可检测到miRNA表达的下降。 RNA提取及RT-PCR过程无特殊注意事项,只是转染过程注意保证转染效率。
Q:内参与miRNA的反转录反应应该分管进行还是同一管进行?原因何在?
A:内参的设置主要是为了校正上样量的差异,保证基因在同一起跑线上比较。如果能保证加样量一致,两种方法没有实质区别。一般基因mRNA检测时一个反转录就可以检测所有mRNA基因,因此反转录是在同一管进行。由于miRNA自身短小的特点,每个miRNA均需用特异的反转录引物进行反转录,这些反转录引物如果不能混在一起,则内参的反转录也分开进行。
Q:不同的miRNA反转录引物可以混合使用吗?
A:引物之间的混合有可能导致引物二聚体的产生及非特异的扩增,因此引物混合前要做预实验比较混合前后对miRNA定量检测的影响,如果证明混合后没有影响才能混合使用,建议每个miRNA还是分开反转录和定量PCR。
Q:不同miRNA的溶解曲线峰值有差异,同一miRNA引物扩增不同RNA模板的溶解曲线峰值有差异?
A:溶解曲线只有用染料做检测时才有,用Taqman探针等则无溶解曲线绘制过程。溶解曲线的绘制原理是内嵌染料结合在体系中所有双链DNA上(dsDNA),包括目标产物、非特异扩增产物、引物二聚体等,随着温度从低于产物溶解点缓慢上升到高于产物溶解点,产物逐渐解链,内嵌染料释出,实时仪器连续监测样本的荧光值逐渐降低,并在产物溶解点处荧光值下降最快,反应在溶解曲线上就是一个峰值;产物完全解链后,仪器监测的荧光值达到平台期。扩增产物的长度、G/C含量、pH值、离子浓度、蛋白残留物等均会影响峰值。对于同一引物扩增不同模板,一般认为峰值相差±1℃时可以忽略不计,否则考虑引物、模板等有问题,需更新重做实验。对于不同引物,若为单峰,则不必考虑峰值差别的影响。
Q:实验所用的酶和其他试剂是否有特殊要求?
A:引物对于酶、其他试剂、仪器等没有特殊的要求,唯一的要求是在相同的条件下进行实验,如用相同的仪器,相同的试剂,相同的程序等。不同厂家的试剂、同一厂家不同批次的试剂、不同的仪器等做出来的结果在扩增曲线,及溶解曲线可能会稍有差异,但这对于相对定量没有影响。 对于不同厂家的试剂或者不同的仪器,建议做一个预实验先摸索我们推荐的反应体系及程序是否可用,如果结果不理想,可根据试剂说明、仪器参数设置原则等做适当调整。
Q:PCR扩增效率低?
A:理论上说,PCR扩增效率接近100%是最理想的扩增效率,但实际操作时,反应的扩增效率应该在90%-110%之间,扩增效率的计算公式为:扩增效率E=10-1/斜率-1,其中斜率为标准曲线的斜率,其范围应该在:-3.1至-3.5。如果扩增效率低,可能的原因是PCR反应中存在PCR酶抑制剂、PCR染料失效、引物设计不当、反应条件未优化等;扩增效率大于100%时,可能的原因是系列稀释样品时的计算或者加样错误、有非特异扩增产物、或者有引物二聚体产生等。
Q:PCR过程设置的对照及反应的问题?
A:阳性对照:一般用RNA反转录的cDNA做模板,检测看家基因,如β-Actin、GAPDH等。目的是检测反转录及PCR过程中反应体系配置、仪器等参数的设置及操作过程有无问题。或者用用质粒做模板,定量PCR定量扩增克隆产物,检测PCR反应体系及操作过程的有无问题。 阴性对照:用水做做模板阴性对照,检测反应体系所用试剂有无污染。用RNA做模板阴性对照,检测抽提RNA过程有无DNA污染。 内参检测:可检测β-Actin、GAPDH等看家基因的表达,以作内参。
Q:对于Bulge-Loop,qRT-PCR Primer中RT反应有没有特殊要求?
A:并无特殊要求,普通的试剂盒即可进行RT反应,实验时将试剂盒的RT primer 换成Bulge-Loop™ RT primer即可。具体的实验信息参阅所使用的RT试剂的操作说明。

CRISPR-Cas9基因编辑常见问题

Q: 混合多个crRNA之前是否需要分别合成gRNA/RNP复合物?

A: 需要。在混合多个crRNA之前,配置crRNA:tracrRNA:Cas9核糖核蛋白复合物有助于抑制不同crRNA之间不必要的相互作用,从而保证与tracrRNA正确杂交。

Q: 如何确保以正确的方向和合适的链设计crRNA前间隔区序列?

A: 因为crRNA可以识别并结合与PAM位点NGG序列相反的基因组DNA链上的19-20个核苷酸,crRNA原型间隔子序列应包括从左往右PAM位点上游的19-20 nt。由于crRNA识别并结合了与PAM位点NGG序列相反的DNA链上的20个碱基,因此通过输入PAM位点上游的20个碱基来对crRNA进行排序。如果通过在线设计工具粘贴CRISPR目标位点,请确保正确的链取向。

Q: 如何评估脱靶效应?

A: 为避免重复使用细胞内技术带来的问题,建议使用无细胞方法(Circle-seq测序或site-seq测序)初步筛选脱靶效应。Guide-seq也是一种可以考虑的无偏差活细胞方法。基于生物信息学预测脱靶位点的方法并不够全面。

Q; PAM序列出现在哺乳动物基因组中的频率是多少?

A: 按照参考人类基因组GG= 5.21%的频率,预计人类基因组中有161,284,793个NGG PAM位点,即每42个碱基大约有一个GG二核苷酸。

Q: 如何阻止CRISPR RNA转染后的细胞死亡?

A: 可能存在以下两种情况:

使用转染试剂的情况下:

转染试剂可能具有细胞毒性,并且细胞死亡的程度可能因为细胞类型而存在差异。如果细胞过度死亡,首先应该使用阳性对照crRNA优化转染反应,该RNA可用于人、小鼠和大鼠细胞。这种操作的目标是使用最少量的脂质转染试剂,并且不会显著影响转染效率。您可以尝试使用其他转染试剂,因为化学上的微小差异会影响毒性。确保寻找针对RNA优化的转染试剂,以转染CRISPR-Cas9 RNA和RNP。

进行电穿孔的情况下:

最佳电穿孔条件随细胞系以及引入细胞中物质(质粒、RNA、DNA或核糖核蛋白)的类型、数量和规模而变化。可以优化的电穿孔条件包括细胞数量、引入物质的相对量、电压、脉冲宽度和脉冲数。

Q: 靶向基因是否对细胞活力至关重要?

A: 靶基因可能对细胞至关重要,因此敲除后会造成细胞死亡。如果阳性对照crRNA起作用,并且靶标被成功敲除,说明该基因很重要。

Q: 看不到CRISPR-Cas9编辑应该怎么做?

A:    1) 仔细检查crRNA序列是否符合预期的物种和靶点位置。例如,验证细胞中的靶点没有显示任何可能影响crRNA效力的多态性。
2) 确认可以使用已知的阳性对照guide RNA(例如用于人类、小鼠或大鼠的阳性对照crRNA)观察到成功的编辑。
3) 如果阳性对照组有效,但实验组crRNA无效,建议测试附近靶点以确定是否可以找到更有效的guide RNA。

Q: 如果目标区域不包含PAM序列,CRISPR-Cas9复合物是否可以结合?

A: 不能。已表征的CRISPR-Cas9复合物不能识别缺乏PAM序列的靶标或识别能力极差。但是,如果序列中不存在化脓性链球菌CRISPR系统中发现的NGG序列,则来自其他细菌物种的CRISPR系统可能会起作用,这些细菌可以识别非标准PAM序列。 例如,嗜热链球菌的PAM序列是NNAGAA和NGGNG,脑膜炎奈瑟氏球菌的PAM序列是NNNNGATT。

Q: 每个基因中都存在PAM序列吗?

A: 很难说。由于人类基因组中双核苷酸“GG”的频率为5.21%,因此基本可以预计大多数基因都含有化脓性链球菌PAM的NGG序列。

Q: PAM序列是CRISPR-Cas9 crRNA结构的一部分吗?

A: 不是。PAM序列位于非互补链,即它位于包含与靶标crRNA相同DNA序列的DNA链上。 PAM序列不应包含在crRNA的设计中。源自化脓性链球菌的最常用的Cas9核酸酶可以识别NGG的PAM序列,该序列位于非靶链上基因组DNA中靶序列的直接下游。

Q: CRISPR基因组编辑效率偏低,应该如何改善这一状况?

A: 评估方法可能会导致编辑效率过低。错配核酸内切酶(例如T7EI)无法检测到单个碱基的变化,而且与直接测序相比会低估实际编辑效率。并非与PAM位点相关的每个序列都会发生相同的情况。例如,原间隔物结合位点的多态性可能会降低编辑效率。离PAM位点越近,碱基错配越不利于编辑。建议在目的基因中尝试2个或3个不同的PAM位点,以确定实现最佳编辑效率的位点。另外,利用对照实验监测或优化CRISPR试剂的递送。

Q: CRISPR基因组编辑后,引物并未扩增靶向区域,为什么?

A: 细胞中的内源性DNA修复机制修复Cas9产生的双链断裂的方式是随机的,可能会改变CRISPR编辑分析中引物结合位点的DNA碱基。建议重新设计引物,使引物远离Cas9裂解位点。

Q: 在目的基因座附近没有PAM NGG序列,怎么办?

A: 如果目的区域太小以至于没有“GG”基序,则需要探索可以识别不同PAM位点的(来自其他有机体的)Cas9核酸内切酶。同时,研究也显示化脓链球菌Cas9可以识别NAG,只是效率较低[Jiang et al. (2013). RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nat Biotech, 31:233–239.]。

Q: 哪种修复途径最常用于修复CRISPR介导的双链断裂?NHEJ还是HDR?

A: 在大多数真核细胞中,非同源末端连接(NHEJ)途径在双链断裂(DSB)修复过程中会产生插入和缺失。但是,在存在与DSB侧翼序列具有同源性的DNA模板的情况下,同源性定向修复(HDR)可以准确地密封DSB。在大多数细胞中,这两种修复途径均具有活性,但是在缺少同源模板的情况下,HDR的效率通常低于NHEJ。该模板自然存在于S期晚期和G2期的姊妹染色质中,也可以人工添加为供体DNA。

HDR效率取决于修复时供体DNA的浓度、供体DNA同源臂的长度、细胞周期以及内源性修复系统的活性。这些因素可以保证在不同细胞系中观察到的HDR效率的高度可变性,尤其是在永生细胞中。确定细胞系的最佳HDR条件非常重要。

寡核苷酸定制合成常见问题

Q: 锁核酸是否可以用于定制DNA和RNA寡核苷酸?

A: 可以。锁核酸可以作为DNA和RNA寡核苷酸使用,我们提供定制合成锁核酸碱基序列。如果要在序列中包含锁核酸修饰碱基,只需在碱基的前面增加“+”,例如:+ A + C + G + T。

Q: 冻干/干燥寡核苷酸如何保存?可以稳定保存多久?

A: 对于长期储存的寡核苷酸来说,温度是最重要的因素。长期储存时,无论寡核苷酸是干燥的还是重悬于未经DEPC处理的水或TE缓冲液(10 mM Tris pH 8.0,0.1 mM EDTA)中,–20°C~-80℃冷藏是最佳的储存方式,可以稳定保存至少1年。

Q: 使用生物素化的引物时是否有特殊的PCR参数要求?

A: 建议在5’末端对引物进行生物素化处理,以避免干扰新生链的延伸。只要将生物素正确放置在5’末端,修饰就不会影响引物的特性。生物素化的引物可以用于未经修饰的寡核苷酸相同的反应条件。如果反应效果不理想,改善Mg2 +和/或退火温度可能会保证更有效的扩增。

Q: 标记探针的处理和存储是否有特殊要求?

A: 在大多数情况下,标记探针应与其他定制的寡核苷酸序列一样处理。建议将探针重悬在TE缓冲液(10 mM Tris pH 8.0,0.1 mM EDTA)中;可以使用未经DEPC处理的无核酸酶水(尽管对保存期限有一定限制)。理想情况下,对于每个重悬的探针都要单独存储并制作几个等分试样,并将其全部存储在–20°C环境下。对于长期存储的寡核苷酸,温度是最重要的因素。长期存储时,无论是将寡核苷酸干燥,还是将其重悬于水(未经DEPC处理)或TE缓冲液中,最好冷冻保存。

对于室温或4°C的储存环境,重悬在TE缓冲液中的寡核苷酸比干燥的寡核苷酸更稳定;储存在水中的寡核苷酸最不稳定。在4°C的环境中,所有条件下储存的寡核苷酸都可以稳定至少60周。

Q: 制备标准脱盐寡核苷酸的过程中是否会造成产物缺失?

A: 尽管大部分产物都是所需序列,但标准脱盐寡核苷酸也会包含异质序列,并且这种异质性会随着寡核苷酸长度的增加而增加。寡核苷酸是通过一系列化学反应由3′端向5′端、每次产生一个碱基而最终实现合成的。化学反应不可能100%有效;偶联反应本身的效率约为99%。因此,每次添加碱基后,大约1%的寡核苷酸链将不会进行碱基延伸。碱基偶联后,加帽步骤可以防止截短的分子参与进一步的碱基添加。由于加帽反应的效率无法达到100%,截短的突变体中只有一小部分会保持未加帽并在后续的偶联步骤中反应,从而导致缺失突变的形成。所得寡核苷酸制品虽然主要由订购提交的目标序列组成,但同时也包括全长寡核苷酸、截短序列和具有内部缺失的序列。

Q: Cy染料是否可以加热到94°C?其稳定性是否有保障?

A: 将Cy标记的寡核苷酸加热至94⁰C并不会引起Cy染料的降解或损失。Cy标记的寡核苷酸常用于PCR相关应用,不会出现问题。但是,Cy染料非常容易受到臭氧的破坏,还存在一些自猝灭问题(参见Gruber et al (2000) Bioconjugate Chem 11:696-704.)。存储时,建议将Cy标记的寡核苷酸保存在-20℃的中性pH溶液中。

Q: 是否可以在室温下退火DNA寡核苷酸?如果可以,应该使用什么缓冲液?

A: 在室温下可以退火寡核苷酸,通过加热的方法使寡核苷酸变性,然后缓慢冷却以退火两条寡核苷酸可以确保更有效的退火,并有利于最稳定的双链体形成;如果选择不加热寡核苷酸,则应谨慎筛选寡核苷酸的二级结构,因为该结构可能会影响退火反应。

退火操作规范:以高浓度(100 µM-500 µM)介质溶解寡核苷酸,例如:1-10 OD260单位/ 100 µL 的STE缓冲液(10 mM Tris pH 8.0、50 mM NaCl,1 mM EDTA)或无核酸酶的双重缓冲液(30 mM Hepes pH 7.5,100 mM KAc)。盐对于寡核苷酸杂交是必需的。将两条寡核苷酸以等摩尔浓度混合,加热至94°C,并使溶液缓慢冷却至室温。对于具有重要发夹结构的序列,冷却过程越平缓越有利,将寡核苷酸放入水恒温槽或微量恒温仪中,然后拔下电源插头,即可轻松实现。所得产物将是稳定的双链构建体。

Q: 是否可以不进行限制性酶切直接合成具有粘性末端的寡核苷酸?

A: 是。您可以设计具有所需突出端的寡核苷酸,并将其直接连接到酶切载体中。如果订购的寡核苷酸具有所需的突出端,则可能需要在连接到酶切载体之前为退火的寡核苷酸添加5’磷酸化修饰,以提高连接效率。您可以订购经过修饰的寡核苷酸,或在收到寡核苷酸后对其进行磷酸化反应。用限制酶切割载体时,限制酶将在载体突出端上留下5’磷酸化,使寡核苷酸突出端可以连接到载体中。

Q: 定制的寡核苷酸是否自带5'磷酸化?

A: 合成的DNA和RNA具有5’和3’OH基团。 如果实验需要5’磷酸基团(例如连接反应),则需要在序列中增加磷酸化修饰。5’磷酸化的修饰为/ 5Phos /,合成时就会将磷酸化修饰加入到5’端的序列中。

Q: 荧光修饰的寡核苷酸是否需要避光保护?

A: 光线破坏寡核苷酸的主要原因是自然光中的紫外线辐射。当暴露在人造光线下时,荧光标记的寡核苷酸相当稳定。在实验室正常使用期间,无需使用棕色试管和/或箔纸覆盖物保护荧光标记的寡核苷酸免受人造光源的伤害。

Q: 是否可以像未标记的标准寡核苷酸一样重悬荧光标记的寡核苷酸?

A: 强烈建议将荧光标记的寡核苷酸重悬并储存在-20°C的缓冲溶液中,例如TE(10 mM Tris pH 8.0,0.1 mM EDTA),这样有助于延长染料标记的寡核苷酸的保质期。另外,配制冷冻原液(100 µM)和几个等分试样可以避免不必要的反复冻融。

Q: 修饰会影响寡核苷酸的稳定性或保质期吗?

A: 对于当前测试的修饰,修饰寡核苷酸的降解模式与标准寡核苷酸相似,即:为了获得最佳稳定性,需要长期保存的寡核苷酸应该在–20°C环境下冷藏。如果需要重悬, TE缓冲液保存(10 mM Tris,0.1 mM EDTA,pH 7.5–8.0)比直接用水保存(未经DEPC处理)更好。-20°C环境下,所用存储介质类型的影响很小,但在较高温度下存储介质的影响就会更加明显。另外,将寡核苷酸储存在黑暗环境中是理想的操作,还应该避免暴露在紫外线下、尽量减少实验室环境光,某些修饰的寡核苷酸尤其如此。

Q: 硫代磷酸酯键会干扰退火吗?

A: 不会,在寡核苷酸上添加硫代磷酸酯键并不会干扰退火。

Q: 标准的脱盐寡核苷酸可以用于哪些实验操作?

A: 标准脱盐寡核苷酸可用于常规PCR、qPCR和DNA测序应用。

Q: 如何浓缩重悬于水中的寡核苷酸?

A: 可以使用Speed-Vac浓缩样品以快速干燥寡核苷酸,或者利用乙醇(与盐一起)沉淀寡核苷酸。需要注意的是,乙醇沉淀可能会导致产物损失。

Q: 如何判断寡核苷酸是否成功退火?

A: 杂交的寡核苷酸或DNA双链体可以通过适当分子量标记进行非变性凝胶电泳。或者,将双链寡核苷酸与单链寡核苷酸并排运行。如果退火成功,双链条带将从单链条带上移。使用紫外线或使用SYBR®Gold等染色使条带可视化。溴化乙锭可能无法充分染色单链DNA以使其可见。

Q: 5'磷酸化引物如何影响PCR?

A: 5’磷酸化的引物不会影响PCR,因为引物延伸发生在3’末端。扩增子每条链上的5’磷酸化对于将PCR产物连接到载体中是必需的。

Q: Na +和Mg ++的浓度如何影响寡核苷酸退火?

A: 一价和二价盐(如Na +、Mg2 +)通过屏蔽带负电荷的DNA序列主链保证双链体形成的稳定性,从而使两条链更加靠近。较高的阳离子浓度也可以保证更稳定的双链体形成。

Q: 如何用硫代磷酸酯骨架合成寡核苷酸?当需要嵌合骨架时,如何确定硫代磷酸酯和磷酸二酯键的位置?

A: 向寡核苷酸添加新的碱基分为四步:1)从5’氧中去除三苯甲基,2)将两个碱基偶联在一起,3)将磷酸氧化以稳定两个碱基的连接;和4)将任何不参与偶联反应的寡核苷酸加帽(以阻止后续碱基的添加)。

具有完整磷酸二酯主链的正常寡核苷酸和具有部分或完整硫代磷酸硫酯主链的寡核苷酸的合成差异在于步骤(3)中氧化剂的选择。磷酸二酯键磷酸盐是通过使用碘和水添加4’氧生成的,硫代磷酸酯键是通过使用Beaucage试剂将硫醚添加到磷酸酯中产生的。一旦将硫醚或氧连接到磷酸盐上,合成就会稳定,并且不会受到后续化学循环的影响。通过循环使用两种氧化剂,嵌合骨架即可以成功构建。

Q: 如何存储和重悬修饰的寡核苷酸?

A: 大多数修饰的寡核苷酸可以像未修饰的寡核苷酸一样存储和重悬。对于长期存储,温度是要考虑的最重要因素。长期储存时,无论是将寡核苷酸干燥,还是将其重悬于水(未经DEPC处理)或TE缓冲液中,最好冷冻保存于-20 ℃环境中。对于室温或4°C的储存环境,重悬在TE缓冲液中的寡核苷酸比干燥的寡核苷酸更稳定;储存在水中的寡核苷酸最不稳定。在4°C的环境中,所有条件下储存的寡核苷酸都可以稳定至少60周。

另外,将寡核苷酸储存在黑暗环境中是理想的操作,还应该避免暴露在紫外线下、尽量减少实验室环境光,某些修饰的寡核苷酸尤其如此。

对于重悬,建议先制备储备溶液,然后再将工作等分试样细分,以避免污染整个储备环境;同时,限制重复冷冻/解冻循环的次数以防止寡核苷酸降解。特定修饰的注意事项:含有光可裂解或光不稳定修饰的寡核苷酸应该远离光线,因此应使用琥珀色试管运输。建议存放在暗管中或用箔纸包裹。

Q: 重悬寡核苷酸时,在试管底部看到一些薄膜,这些薄膜是否是没有重悬到溶液中的寡核苷酸?

A: 包装寡核苷酸的塑料管底部有时会显得浑浊。为了确定寡核苷酸是否已完全溶解,可以在重悬液上读取OD260读数。在寡核苷酸完全溶解的情况下,如果读数低于预期,建议将寡核苷酸加热至65°C 5-10分钟,然后涡旋振荡几秒钟。一些修饰和序列可能会造成寡核苷酸难以溶解。

Q: 收到干燥的寡核苷酸,但是试管看上去是空的。肉眼可以直接看到寡核苷酸吗?

A: 大多数寡核苷酸是透明无色的,通常只能在试管中看到些许薄膜或残留物。由于运输可能会使透明的沉淀物脱落,因此在打开试管并重悬寡核苷酸时务必小心。建议在微量离心机中短暂旋转离心管,使沉淀物落入离心管底部。在重悬过程中,可以将重悬介质吸移到试管侧壁以获取所有的寡核苷酸沉淀物。

Q: 是否可以将寡核苷酸重悬并存储在DEPC处理过的水中?

A: 不可以。不建议将寡核苷酸重悬或存储在DEPC处理过的水中。经DEPC处理的水可能是酸性的,会导致寡核苷酸的脱嘌呤作用,从而导致降解。为了获得最佳稳定性,需要长期保存的寡核苷酸应该在–20°C环境下冷藏。如果需要重悬, TE缓冲液保存(10 mM Tris,0.1 mM EDTA,pH 7.5–8.0)比直接用水保存(未经DEPC处理)更好。-20°C环境下,所用存储介质类型的影响很小,但在较高温度下介质类型的影响就会更加明显。将寡核苷酸储存在黑暗环境中是理想的操作,还应该避免暴露在紫外线下、尽量减少实验室环境光,某些修饰的寡核苷酸尤其如此。另外,建议通过准备冷冻储存原液(100 µM)和几个等分试样避免不必要的反复冻融。

Q: 阻隔寡核苷酸的3'端修饰方法有哪些?

A: 有几种修饰方法可以阻止3’延伸。大多数3’修饰都可以阻止PCR延伸,其中最常用的修饰是3’ddC、3’Inverted dT、3’C3间隔基、3’氨基和3’磷酸化。

Q: 荧光标记的寡核苷酸及荧光修饰的稳定性如何?

A: 荧光标记的寡核苷酸的稳定性和荧光功能类似于标准寡核苷酸的稳定性。为了获得最佳稳定性,需要长期保存的寡核苷酸应该在–20°C环境下冷藏。如果需要重悬, TE缓冲液保存(10 mM Tris,0.1 mM EDTA,pH 7.5–8.0)比直接用水保存(未经DEPC处理)更好。-20°C环境下,所用存储介质类型的影响很小,但在较高温度下存储介质的影响就会更加明显。

需要注意的是,暴露于自然光或臭氧不利于荧光基团的稳定性。

Q: 是否不应该纯化包含混合碱基(简并或随机寡核苷酸)的序列?

A: 是否需要订购纯化寡核苷酸因研究需求而异。纯化涉及合成总产物的馏分收集,降低寡核苷酸的变异性,可能会使随机碱基比率产生偏差,从而导致总体随机性降低。鉴于这一点,纯化在某些情况下仍有必要,尤其是使用非常长或高度修饰的寡核苷酸时。

Q: 在重悬之前,是否应该采取一些措施准备寡核苷酸试管?

A: 建议在打开干燥寡核苷酸试管之前先对其进行短暂离心,确保寡核苷酸沉淀物位于试管底部,并且在打开盖子时不会丢失。加入未经DEPC处理的水或缓冲液(例如TE)之后,短暂涡旋试管,但不要离心。

Q: RNA的存储方式是否与DNA不同?

A: 固有的化学结构决定了RNA不如DNA稳定。降解RNA的RNA酶也比DNase更普遍。由于与DNA相比,RNA对降解更敏感,因此建议使用含有螯合剂的中性至弱酸性缓冲液短期存储RNA。但是,RNA在-80°C环境下作为乙醇沉淀物存储时最稳定,长期存储尤其如此。 RNA寡核苷酸存储的关键是避免使用RNase。

Q: 什么是适配体?为什么它们越来越受欢迎?

A: 适配体是通过3维结构以极高的亲和力和特异性结合至特定靶分子的RNA或DNA寡核苷酸(或肽)。适配体通常使用SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)等进行鉴别,经过几轮筛选之后,对靶分子具有更高亲和力和特异性的寡核苷酸会从序列库中被分离出来。这些分子可以替代用于识别特定靶标的抗体,具有与针对其靶标的抗体相似的亲和力,同时稳定性更高、更易于大规模生产、免疫原性低以及可以以低抗原性靶向分子。与抗体一样,适配体具有广泛的应用范围,可以用作药物、诊断和治疗工具、分析试剂和生物成像分子。在体外和体内使用时,序列可以通过修饰增强稳定性。

Q: DNA / RNA杂交寡核苷酸有什么用途?

A: DNA / RNA杂交最常用于RNA沉默,其中DNA碱基置于siRNA分子的末端可以减少细胞内的降解。其他适用范围包括RNase H的基因分型和SNP检测。

Q: 什么是RNA寡聚嵌合体?

A: RNA嵌合体是既包含RNA又包含DNA或2’氧甲基碱基的寡核苷酸,例如ASO。

Q: 荧光标记的寡核苷酸及荧光修饰的稳定性如何?

A: 荧光标记的寡核苷酸的稳定性和荧光功能类似于标准寡核苷酸的稳定性。为了获得最佳稳定性,需要长期保存的寡核苷酸应该在–20°C环境下冷藏。如果需要重悬, TE缓冲液保存(10 mM Tris,0.1 mM EDTA,pH 7.5–8.0)比直接用水保存(未经DEPC处理)更好。-20°C环境下,所用存储介质类型的影响很小,但在较高温度下存储介质的影响就会更加明显。

需要注意的是,暴露于自然光或臭氧不利于荧光基团的稳定性。如果荧光修饰的寡核苷酸需要暴露在持续的光线下,则应考虑使用光源保护罩(例如棕色试管和/或箔纸)。

Q: RNA与DNA的稳定性如何?

A: 由于其化学结构,RNA本质上不如DNA稳定。 另外,RNase在标准实验室条件下比DNase更为普遍。

Q: 寡核苷酸退火的标准操作是什么?

A: 有时需要利用单链寡核苷酸制备双链DNA。尽管退火过程很简单,但注意一些细节可以大大减少不必要的单链材料。

操作方法:
将每个寡核苷酸溶解于高浓度(1-10 OD260单位/ 100μL)双重缓冲液(100 mM乙酸钾,30 mM HEPES,pH 7.5)中。适量的盐对于寡核苷酸杂交是必需的;
将等摩尔量的两个序列混合在一起。如果使用不同的量,则会剩下某一个单链序列;
加热至94°C并逐渐冷却至室温。对于具有重要发夹结构的序列,冷却/退火过程越平缓越有利。将寡核苷酸放入水恒温槽或微量恒温仪中,然后拔下电源插头,即可轻松实现;
所得产物为稳定的双链形式,可以在4°C保存或冷冻。

温馨提示:
如果产物用于连接反应,则可能需要添加5′-磷酸盐,在寡核苷酸合成(化学磷酸化)时或在此之后随时使用PNK(酶促磷酸化)操作即可。如果寡核苷酸相对较长或需要用于克隆,建议从PAGE纯化的寡核苷酸开始。

Q: 何时使用随机(简并、摇摆、混合)碱基寡核苷酸?

A: 引物中使用了混合碱基,以结合在引物结合位点包含变异性或混合序列的模板。混合碱基也可用于在克隆文库和定点诱变中创造多样性。

Q: 什么时候进行HPLC纯化?

A: HPLC纯化有助于去除截短的合成产物并提高纯度。对于长度大于40个碱基的寡核苷酸和多种修饰的寡核苷酸,建议进行纯化。另外,由于其合成的化学性质,许多修饰需要HPLC纯化。HPLC纯化通常可以保证约85%的纯度。只要序列不被过分修饰或不包含明显的二级结构,就可以为不超过60个碱基的序列提供纯度保证。通常,HPLC产生的寡核苷酸纯度略低于PAGE,但保证产量更高。

Q: Cy染料应该连接在核苷酸的哪个位置?

A: 5’和3’Cy染料通过磷酸二酯键连接到核糖的羟基上;内部Cy染料通过其间存在染料的碱基的磷酸二酯键连接到主链上。

Q: 应该在哪里放置硫代磷酸酯键以增加寡核苷酸的稳定性?

A: 在寡核苷酸的3’和5’末端放置硫代磷酸酯键的3-5个核苷酸可以抑制核酸外切酶降解;在整个寡核苷酸中引入硫代磷酸酯键也有助于减少核酸内切酶的影响。

Q: 为什么寡核苷酸呈现黄色/棕色?

A: 在定制化合成中,颜色变化是正常的。随着浓度的增加,变色的可能性更大。

Q: 相比干燥保存寡核苷酸,为什么建议在TE缓冲液中冷冻保存?

A: 需要注意,“干燥”的寡核苷酸总会存在一定程度的水分,实际上不可能完全干燥。因此,长期保存时,重悬在TE缓冲液(10 mM Tris,0.1 mM EDTA,pH 7.5-8.0)中比干燥保存更稳定。但是,短时间运输时,干燥或在未经DEPC处理的水中储存的寡核苷酸非常稳定。

Q: 为什么FAM标记的寡核苷酸不如之前的明亮?

A: 在适当的条件下,荧光素染料(例如FAM)对于一系列操作都具有出色的信号强度,但是易受较高的光漂白速率影响,并且对酸性环境敏感,酸性环境会随着时间的流逝削弱信号。随着染料的质子化,信号将迅速降解,因此FAM标记的寡核苷酸应保存在pH值7.2或更高的溶液中以限制降解。为了最大程度地减少荧光素标记的寡核苷酸的光漂白,建议使用灵敏度较高的检测系统尽可能降低强度激发,同时配合宽带通滤光片使用。

Q: 为什么最终产率(交付产率)比之前要低?

A: 每一次合成都是唯一的,实际产量取决于序列组成、序列长度和纯化方法,同时也受到制造过程中的其他变量影响,例如化学批次、合成器等。

Q: 寡核苷酸在运输和交付过程中会降解吗?

A: 处于干燥状态的寡核苷酸可以稳定保存数月,即使在延误的情况下,在运输过程中也不会发生过多的降解。但是,相比干燥的寡核苷酸,重悬的寡核苷酸相对较不稳定。干燥的寡核苷酸或在未经DEPC处理的水中储存的寡核苷酸在短时间内运输时是非常稳定的。

Q: 与聚丙烯管相比,利用聚苯乙烯管重悬是否会耗费更多的寡核苷酸?

A: 将DNA储存于聚苯乙烯中时,寡核苷酸会由于被吸附到管壁中而损耗。建议使用聚丙烯管进行寡核苷酸存储,以最大程度地减少此类损失。

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