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动物体内实验常见问题

Q:不经过化学修饰的siRNA可否用于动物实验?

A:采用专门的转染试剂或特殊的给药方法,不经修饰的siRNA也可用于动物实验,但是动物实验对siRNA试剂在体内的稳定性和半衰期有较高的要求,通常推荐经特殊化学修饰或In vivo级别的试剂,以提高其稳定性和半衰期。

Q:选用哪一类化学修饰可以用于siRNA in vivo实验?

A:锐博生物提供多种化学修饰方式,常用的有2’OMe,FU/FC,PS等,您可以自行选择修饰方案,此外我们还提供动物实验专用的siRNA。

Q:修饰的siRNA在细胞水平的实验已经完成,是否可以用余下的siRNA做动物实验?

A:一般不建议用余下的siRNA试剂,因为动物实验体内条件更加复杂,一般需要采用专门的处理标准来合成siRNA,故应购买更可靠的动物实验专用siRNA。

Q:动物实验用的siRNA有Standard, in vivo;PAGE, in vivo;HPLC, in vivo,三者有什么区别,该如何选择?

A:三者均按照动物实验siRNA标准来处理或纯化,均可以用于动物体内实验。区别在于其纯度不同:Standard即全长RNA含量不低于80%;PAGE和HPLC即全长RNA含量不低于95%。试剂纯度越高,特异性和靶向性会更好,作用效果更加可靠,但成本也会更高。因此,如经费允许且要求高的条件下,建议选择更高纯度的siRNA进行实验。

Q:使用锐博生物动物实验用siRNA有发表过文章吗?是否可以提供参考?

A:有,请联系我司业务代表

Q:针对不同的器官如何给药?给药的推荐量是多大?给药频率是多少?

A:给药方法大致分为系统给药(如静脉给药、腹腔给药等)和局部给药(如皮下注射,玻璃体给药,鞘内给药等),一般需要根据不同的器官来选择,给药量也视不同的对象而异,主要是体重情况,如肝脏、肾脏常用静脉注射(系统给药);而皮下肿瘤则常用到瘤内注射(局部给药);系统给药每次注射5~20nmol/20g体重,局部给药则需每次注射1~5nmol/20g体重,给药频率往往是一周2~3次。

Q:进行小鼠的体内研究需要多少量的siRNA?

A:首先需要根据动物模型和实验方案,确定给药量和给药次数,然后计算出实验所需的总用量。系统给药每次注射5~20nmol/20g体重,局部给药则需每次注射1~5nmol/20g体重,给药频率往往是一周2~3次。

Q:miRNA agomir/antagomir针对不同的器官如何给药?给药的推荐量是多大?给药频率是多少?

A:给药方法大致分为系统给药(如静脉给药、腹腔给药等)和局部给药(如皮下注射,玻璃体给药,鞘内给药等)。给药方法的选择需要根据不同的器官来选择,而给药量因不同的给药量而异。如肝脏、肾脏常用静脉注射(系统给药);而皮下肿瘤则常用到瘤内注射(局部给药)。系统给药: agomir每次注射5~20nmol/20g体重, antagomir每次注射50~200nmol/20g体重;局部给药: agomir每次注射1~5nmol,antagomir每次注射5-20nmol。给药频率往往是一周2~3次。

细胞转染实验常见问题

Q:miRNA agomir/antagomir针对不同的器官如何给药?给药的推荐量是多大?给药频率是多少?

A:给药方法大致分为系统给药(如静脉给药、腹腔给药等)和局部给药(如皮下注射,玻璃体给药,鞘内给药等)。给药方法的选择需要根据不同的器官来选择,而给药量因不同的给药量而异。如肝脏、肾脏常用静脉注射(系统给药);而皮下肿瘤则常用到瘤内注射(局部给药)。系统给药: agomir每次注射5~20nmol/20g体重, antagomir每次注射50~200nmol/20g体重;局部给药: agomir每次注射1~5nmol,antagomir每次注射5-20nmol。给药频率往往是一周2~3次。

Q:如何选择转染方法和转染试剂?

A:转染方法和转染试剂的选择要根据不同细胞来选择,对于容易转染的细胞可以选择riboFECT CP转染试剂,对于mRNA/长链RNA转染、原代细胞或难转染的细胞,可以选择riboFECT mRNA转染试剂,对于高效的蛋白转染,可以选择riboFECT Protein转染试剂。 锐博生物提供从siRNA/miRNA、mRNA/长链RNA到蛋白质的全系列转染试剂,请根据下表确定适合您的转染试剂

siRNA/miRNA/质粒转染试剂,基因抑制效率高 mRNA/长链RNA转染试剂,适用于原代细胞 蛋白质转染试剂,可实现最高效转染
riboFECT™ CP转染试剂 riboFECT™ mRNA转染试剂 riboFECT™ Protein转染试剂
试剂规格 0.5ml, 1ml 0.5ml, 2.5ml 0.5ml, 2.5ml
样品类型 siRNA, miRNA mRNA, 长链RNA 蛋白质
转染效率 极佳 极佳 最高,可高达98%
细胞活力 极佳 极佳
细胞毒性 极佳 超低 几乎无细胞毒性
转染细胞系(部分) HeLa,A549,HEK293T,HCT-116,NIH/3T3,HepG2,HNE1,L6,5637,H-bc,HSC,C2C12,Sertoli,CNE-2,5-8F,HAEC,DRG,CF,THP-1,MEL,PBMC,NSC,MSC,U2OS human fibroblasts,CHO-K1,B16-F10,HEK293 HEK293,B16-F10,COS-7,COLO 205,dendritic cells (DC),H9c2,human fibroblasts (primary cells),HUVEC (primary cells),Jurkat,MC3T3-E1,MEF (primary cells),microglia,mouse podocytes (primary cells),NIH/3T3,SK-OV-3,U-373 MG
Q:对于难转染的细胞,应该如何提高其转染效率?转染效率又该如何确定?

A:1.对于贴壁细胞,推荐采用转染试剂转染即可; 2.对于难转染的细胞的转染,一般建议使用电转的方法,但是由于电转的方法对细胞损伤比较大,该方法也未必是最佳的,可以选用riboFECT mRNA转染试剂。 常采用荧光标记siRNA在荧光显微镜、共聚焦显微镜或流式细胞仪检测转染效率,具体请参产品说明书。

Q:细胞的转染效率是否与siRNA序列相关?

A:转染效率高低取决于细胞自身及转染方法,与siRNA序列无直接的关系。

Q:转染siRNA时细胞密度多少为宜?

A:依不同的转染方法或转染试剂而定。如使用riboFECT™ CP Reagent转染siRNA,细胞密度达到50%~80%最佳。

Q:转染时的培养基要求,可否含血清?

A:不同的转染试剂要求可能不同,对于riboFECT™ CP Reagent,在配制siRNA和riboFECT™ CP混合物时不能含有血清,但细胞培养基可以含有血清,但不能含有抗生素。

Q:siRNA储存液体浓度和工作浓度有何区别?

A:siRNA的贮存浓度就是保存的最佳浓度,锐博推荐的贮存液浓度为20 μM;而siRNA的工作浓度是使siRNA能够达到最佳沉默效果的转染浓度,一般10~100 nM范围内,锐博生物推荐的转染浓度是50nM。

Q:转染时该如何分组?分组的目的是什么?

A:

A组(必需)针对目的基因siRNA(重复三个孔)knockdown目的基因的表达
B组(必需)阴性对照siRNA(重复三个孔)用非特异的siRNA序列证明RNAi作用的序列特异性
C组(必需)转染试剂对照(重复三个孔)排除转染试剂对细胞的毒性或对目的基因表达的影响
D组(必需)空白对照(重复三个孔)用于检测实验过程中细胞的生长状态
E组(可选)阳性对照siRNA(重复三个孔)用于排除实验体系和实验操作的问题
F组(可选)荧光对照siRNA(重复三个孔)用于转染效率。当不明确细胞转染效率时,这一组为必需。

Q:用荧光对照siRNA如何检测转染效率?是不是每次实验都必须做?

A:我们提供的转染对照siRNA带有Cy3或Cy5荧光标记,可以通过荧光显微镜、共聚焦显微镜、流式细胞仪等荧光检测仪器检测。除此之外,还应该通过阳性对照实验进一步确定。转染效率的高低主要与细胞自身相关,同等实验条件下,每次转染效率应该是相近的,因此不必每次都做。但如果每次实验都做一个荧光对照组,将会更有利于排除一些实验问题。

Q:转染后出现细胞死亡是什么原因?如何优化转染条件?

A:如果是转染试剂对细胞的毒性,则可以减少转染试剂用量,或换用其他转染试剂或转染方法;如果细胞自身状态不好,则建议重新实验,必要时重新复苏细胞。

Q:到了转染时间发现细胞密度太低,该如时转染,还是让细胞多长一天再转染?

A:细胞生长需要一定的密度,而转染试剂对细胞有一定的毒性,如果转染时细胞密度过低,细胞可能会因此生长异常甚至死亡。转染前要求良好的细胞状态和细胞活性,一般也不建议用生长几天的细胞做转染。

阳性对照和阴性对照实验常见问题

Q:为什么说阳性对照在RNA干扰实验中很重要?

A:阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。也就是说,当您看到siRNA阳性对照的预期实验结果时,可确保您的实验方法中转染、RNA提取物和检测方法是可靠的。

Q:阳性对照及其阴性对照在RNAi实验中的作用?如何选择?

A:阳性对照指的是已经验证的针对看家基因或报告基因有效的siRNA,用于监测实验体系和实验方法的可行性。锐博生物提供针对GAPDH,ACTB,GFP/EGFP有效的siRNA作为阳性对照,您可以根据具体的实验需要选择。阴性对照往往是非特异的siRNA,主要用于说明siRNA作用的特异性,可以根据实验需要选择通用的序列(universal)或是随机打乱的序列(scramble)。

Q:各组阴性对照的检测结果是否应该一样?如果偏差很大该怎么办?

A:正常情况下,各组阴性对照的检测结果应该是相近的。如果偏差过大,只需考虑实验结果的准确性。另外,对于一些特定的基因,比如与细胞难受压力相关的基因,又如参与细胞免疫的基因,可能会对外界压力比较敏感,使得各组对照的基因表达发生变化不一致。

RNAi实验常见问题

Q:siRNA荧光染料的最大吸收率和发射率各在哪个波段?

A:FAM在495nm处有最大吸收率,在520nm处有最大发射率。 Cy3在550nm处有最大吸收率,在565nm处有最大发射率。 Cy5在643nm处有最大吸收率,在667nm处有最大发射率。

Q:siRNA作用效果应该如何检测?

A:通常可以从三个方面来相互验证siRNA的作用效果 1) 用Realtime RT-PCR方法,从mRNA水平检测: 2) 用Western blot,ELISA等方法,从蛋白水平检测; 3)用高内涵显微镜,根据目的基因的功能,从细胞表型水平检测。

Q:siRNA在细胞内可以作用多长时间?什么时候才是最好的检测时间?

A:siRNA介导的RNAi属于瞬时现象,不能稳定传代,一般其作用时间不可能维持很长时间,通常建议在转染后3~4天内完成检测。最佳检测时间,因细胞、目的基因而异,多在转染后24~48小时之间检测。

Q:为什么要强调mRNA水平检测?可以直接检测蛋白和功能吗?

A:siRNA直接作用于mRNA,因此mRNA水平检测是最直接在指标。 很多客户认为,mRNA降解的直接结果应该是对应蛋白质含量的下降,因此蛋白水平的检测结果也应该可以作为有效性的检测指标。事实上,很多情况下会出现mRNA下降水平与蛋白下降水平不对应的现象。其可能原因有: 1) 与选择的检测时间有关。可能因mRNA的下降尚未反映在蛋白量的变化上或者未达到足以检测的水平,所以一般建议蛋白和功能检测时间要稍稍推后。 2) 与蛋白在细胞中的表达情况有关。mRNA的翻译过程非常复杂,细胞内基因的表达总要维持一个平衡,某些蛋白表达量到一定的程度之后,足以维持其细胞功能,将可能暂时“关闭”表达的功能,转录出来的部分mRNA可能不参与蛋白翻译的过程,故mRNA水平下调与蛋白水平下调并非完全成正相关的关系。 3) 可能还会涉及到更加复杂的机制。

Q:干扰效率多高才是好的靶点?

A:没有明确的界定,干扰效率高低因不同的细胞类型和不同的基因而异。不同细胞类型的转染效率也不尽相同,不同基因的表达水平也相差较大,主要看干扰效果而定。

Q:沉默效果不理想,应该如何处理?

A:最常见的影响沉默效果的两个原因:转染效率低和siRNA序列设计的效果不理想。如果您初次使用siRNA或采用了新的细胞系,并发现沉默效果不佳,我们建议您对转染效率进行检测,并选择优化转染条件。如果您已经对实验转染条件进行优化但是问题依然存在,我们建议您换用另一种转染试剂或是采用其他技术,这也许能提高转染效率。如果已经提高了转染效率但是沉默效果仍然未达到要求,可能是因为siRNA序列设计的效果不理想。

Q:siRNA使得目的基因表达上调了,这是什么原因?该怎么解决?

A:可能的原因: 1.由于转染浓度过高或转染条件不合适,导致基因表达异常,可尝试优化转染条件; 2.与细胞类型相关,可能某些细胞对外界刺激比较敏感,可尝试换用其他细胞; 3.检测结果不准确,优化检测条件(RNA质量、引物设计、反应条件等)

Q:我从阴性对照实验中得到和特异性RNAi相同的结果,这说明了什么?

A:可能的原因: 1.非特异性作用的结果:由于转染浓度过高或转染条件不合适,导致基因表达异常,可尝试优化转染条件; 2.所选用的阴性对照siRNA序列发生了不预期的off-target作用,对目的基因也发生干扰作用,尝试换用其他的阴性对照siRNA。

Q:用100nM 的siRNA转染时只得到50%沉默效率,可否把siRNA的浓度增加到200nM甚至400nM?

A:当干扰效率不佳时,可以在一定范围内适当优化转染浓度,通常优化的范围是10~150nM,但不宜过大,高浓度的siRNA将可能增加非特异性作用的可能性并对细胞产生毒性。

Q:同样的siRNA,为什么在细胞A很有效,在细胞B则没有效果?

A:不同细胞的转染效率不一样、基因表达水平也不一样,这些都与siRNA的作用效率有关。

Q:siRNA该如何设计?

A:我们有自主开发的在线的设计软件siCatchTM siRNA design tool。客户提供基因名称或基因ID,锐博生物可以提供免费设计的服务。

Q:siRNA的末端悬垂是必须的吗?该如何选择?

A:传统的siRNA结构是19 mer + 2’悬垂的结构,目前也有一些siRNA是顿末端的。悬垂的选择上,dTdT/UU是最常见的,另外也有以dNdN(N代表与基因序列对应的碱基)作为悬垂的。悬垂的选择对于siRNA的作用效率并没有很大影响。

Q:如果知道某一基因产物的蛋白序列,可以设计一条靶向这个蛋白的siRNA吗?

A:siRNA的作用是在RNA水平,而不是在蛋白质水平。要设计siRNA,必须准确知道靶mRNA序列。由于遗传密码的兼并性和密码子的偏移,不可能通过蛋白序列准确预测核苷酸序列。转录后的RNA前体通过剪接去除内含子序列形成成熟的mRNA。因为siRNA的功能是酶解mRNA序列的,根据基因组序列设计的RNA序列有可能落在内含子区,导致设计的siRNA无效,所以应该根据mRNA序列而不是基因组序列来设计siRNA。

Q:为什么在已公布的siRNA序列中5’端部分有AA结构?这一结构是否是必须的?

A:过去“AA”代表siRNA靶序列的起始端,研究者常将它们作为序列组成的一部分,但它们却不是作为合成siRNA序列的一部分。siRNA靶序列往往写成“AA-(N19)”的格式,其中“AA”用于提示3’端悬垂为dTdT 或UU。N19靶序列和两个悬垂组合形成一个21-mer的双链。这一结构并不是siRNA设计的必需要求。

Q:针对人体基因设计的siRNA对其他物种是否也有效?

A:尽管不同物种的基因是同源基因,但是这些同源基因的表达序列都存在或多或少的差别,而siRNA要求序列特异性,即完全互补配对,故大部分siRNA无法满足多物种基因沉默的效果。即便是针对不同物种的同源基因的相同片段,由于基因表达差异,也不能保证其在不同物种中的基因沉默效果。

Q:siRNA是否可以做修饰或标记,该如何选择?

A:可以对siRNA做修饰或标记,我们可供选择的修饰或标记见化学修饰siRNA部分。为避免修饰或标记后对siRNA作用效率的影响,修饰或标记多选择在正义链(需根据具体的实验要求而定)。

Q:化学合成的siRNA靶点序列是否可以用于构建shRNA真核表达质粒载体?

A:可以,但不同shRNA表达载体对序列还有特定的要求,因此必须考虑表达载体的具体要求来确定可行性。

Q:化学合成方法筛选出有效的序列构建到shRNA表达载体之后是否会同样有效?

A:理应有效,但由于载体表达相对比较复杂,其有效性涉及到载体是否能否在细胞内强表达、是否可以被正确加工等问题,因此不排除出现shRNA不工作的情况。

Q:shRNA表达载体的方法有效的序列用化学合成的方法来做是否会同样有效?

A:shRNA表达载体的方法容易出现“假阳性”,不排除出现siRNA不工作的情况。

Q:siRNA是否需要低温运输?

A:我们的siRNA以冻干粉的形式供货,可以在常温下运输。收到产品后应在-20~-80℃条件下保存。

Q:shRNA表达载体的方法有效的序列用化学合成的方法来做是否会同样有效?

A:shRNA表达载体的方法容易出现“假阳性”,不排除出现siRNA不工作的情况。

Q:由于快递的原因将近一周才收到siRNA,室温条件下放置这样长时间,siRNA会降解吗?

A:冻干粉形式的siRNA在常温下可以稳定存在1-2周。

Q:shRNA表达载体的方法有效的序列用化学合成的方法来做是否会同样有效?

A:shRNA表达载体的方法容易出现“假阳性”,不排除出现siRNA不工作的情况。

Q:siRNA应该如何溶解,如何保存?

A:开盖之前请短暂离心,加入灭菌的RNase-free H2O或者灭菌的ddH2O,配制成20μM贮存液,适当分装并于-20℃-80℃条件下保存。

Q:我需要配置浓度为20uM的储存液,如何计算重悬siRNA缓冲液的量?

A:锐博生物为您提供的siRNA是以nmol为单位的冻干粉。样品浓度的计算如下:(siRNA的量,nmol)/(重悬体积,uL)=样品浓度,umol/L。例如:您购买了5nmol的siRNA,想溶解为20uM的样品,应该使用250uL缓冲液溶解,配置为20uM的样品。具体的溶解体积可以参见下表: 表1 20μM储存液的配置参考

siRNA(nmol)0.250.512520
溶解体积(μl)12.525501002501000

Q:siRNA溶解后保存在-20℃,反复使用多次,会影响siRNA的质量?

A:我们建议溶解后分装保存,一般不建议溶液形式的siRNA反复冻融超过5次。

Q:siRNA使用前是否需要先退火?

A:我们的siRNA已经完成退火,可以直接使用。

Q:转染miRNA mimic和inhibitor如何确定转染率?

A:最直接的方法为加设转染对照,直接观察转染率。

Q:miRNA mimic和inhibitor转染时的浓度是否一样?

A:由于miRNA inhibitor其竞争抑制性的作用机制,其往往需要较大的用量才能观察到预期的抑制效果,则相当于mimic的几倍用量。推荐的mimics转染浓度为50nM,inhibitor转染浓度为100nM。

Q:多个miRNA的共转染怎么做?

A:根据每个miRNA的转染浓度取量,按照常规的方法转染即可。

Q:miRNA mimic实验结果不能重复?

A:可能与miRNA表达及作用的时空特异性相关

Q:miRNA inhibitor及其miRNA antagomir的区别是什么?该如何选择?

A:miRNA inhibitor和antagomir都用于抑制miRNA的功能研究,二者的区别也主要在修饰方式上。细胞实验可以二者选择其一,而动物实验选择antagomir相对比较有优势。

qPCR实验常见问题

Q:miRNA qPCR实验的重复如何设置?

A:重复分为两类,一类是生物重复,一类是技术重复,生物重复是从处理样本后重新提取RNA开始,是几次完全独立的实验;技术重复可以在cDNA合成或者PCR反应的两个过程任选一步进行重复,主要看实验操作过程有无问题,一般选择在PCR时重复3次。

Q:5S qRT-PCR的产物有多大?

A:91bp,人、小鼠、大鼠的5S是同源的。

Q:U6 qRT-PCR的产物有多大?

A:94bp,人、小鼠、大鼠的U6是同源的。

Q:Bulge-Loop™ miRNA qRT-PCR的产物有多大?

A:80bp左右,不同miRNA的qRT-PCR的产物长度不尽相同,具体长度要依据实际引物长度而定。

Q:NTC 有扩增 ?

A:可能原因: 1) 试剂污染;2) 引物二聚体 解决办法: 1) 更换试剂;2) 降低引物使用浓度 ;3) 调整程序设置,如提高退火温度,适当增加读板温度

Q:非特异性扩增有杂峰?

A:可能原因: 1) RNA被基因组DNA污染 2) 引物混杂有其他引物 3) 引物二聚体存在 解决办法: 1) 提取更高质量的RNA,并用DNaseI处理样本 2) 在冰上配制反应体系,降低非特异的起始扩增 3) 调整反应体系,如降低引物使用浓度,降低起始模板量 4) 调整程序设置,如提高退火温度,适当增加读板温度 5) 更换被污染的RNA模板、引物、酶等试剂

Q:qPCR产物量少该如何解决?

A:可能的原因: 1) RNA模板质量低或者cDNA模板质量低 2) 靶miRNA基因表达量低或者无表达,无法检测 3) 试剂中存在PCR抑制剂 4) PCR仪是否正常运转 5) PCR程序设置有无问题,如:循环数不够、无读板过程、无制作融解曲线的过程等 6) PCR过程所用试剂少加一种或多种,如,sybr、正反向引物、模板 7) PCR过程所用的酶、sybr等试剂有无失效等问题 8) 定量PCR引物的问题:如使用浓度太低、引物设计不好、引物合成序列有误等 解决办法: 1) 建议在试验中加入阳性对照RNA 2) 增加RNA和/或cDNA模板的量 3) 保证定量PCR仪运转正常 4) 调整程序设置,如增加循环次数,正常读板过程和溶解曲线制作过程 5) PCR反应所使用的酶一般为热启动聚合酶,预热过程需根据酶说明书设置 6) 保证PCR反应体系配制过程中无少加或漏加试剂,并且试剂均有效 7) 第一链的反应产物在进行PCR扩增时,在总的反应体系中的含量不要超过1/10

Q:cDNA产量低该如何解决?

A:可能的原因: 1) RNA模板质量低 2) 对mRNA浓度估计过高或浓度未测准确 3) 反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足 4) 反应体系少加试剂 5) 控温过程不正确,高温使反转录酶失效,低温达不到反转录酶的最佳反应效率 6) 反应体积过大,导致试剂被稀释 解决办法: 1) 重新提取高质量的RNA模板,并准确测定其浓度 2) 保证加入各种试剂建立完整的反应体系 3) 保证控温过程正确 4) 反转录反应体系不要超过50uL

Q:扩增曲线先正常上升,后来却下降,溶解曲线不规则,原因何在?

A:反应体系中存在酶抑制剂或者其他原因导致PCR酶失活或者染料降解,建议重提RNA模板,更换PCR试剂重新实验。

Q:转染了mimics或inhibitor后,可否用qPCR引物检测转染后miRNA量的变化,注意的问题有哪些?

A:我们的实验发现,对于转染效率比较高的细胞(如hela,A549等) ,一般转染mimics 50nM后与no-target相比高出约1万倍,转染表达miRNA的质粒后与空白对照质粒相比高出几百倍,inhibitor理论上与miRNA结合后阻止其与靶mRNA的结合,inhibitor并未导致miRNA的降解,因此qPCR可以检测mimics转染后miRNA表达的上升,无法检测inhibitor转染后miRNA表达的下降,当然如果某些inhibitor确实通过未知途径导致miRNA的降解也可检测到miRNA表达的下降。 RNA提取及RT-PCR过程无特殊注意事项,只是转染过程注意保证转染效率。

Q:内参与miRNA的反转录反应应该分管进行还是同一管进行?原因何在?

A:内参的设置主要是为了校正上样量的差异,保证基因在同一起跑线上比较。如果能保证加样量一致,两种方法没有实质区别。一般基因mRNA检测时一个反转录就可以检测所有mRNA基因,因此反转录是在同一管进行。由于miRNA自身短小的特点,每个miRNA均需用特异的反转录引物进行反转录,这些反转录引物如果不能混在一起,则内参的反转录也分开进行。

Q:不同的miRNA反转录引物可以混合使用吗?

A:引物之间的混合有可能导致引物二聚体的产生及非特异的扩增,因此引物混合前要做预实验比较混合前后对miRNA定量检测的影响,如果证明混合后没有影响才能混合使用,建议每个miRNA还是分开反转录和定量PCR。

Q:不同miRNA的溶解曲线峰值有差异,同一miRNA引物扩增不同RNA模板的溶解曲线峰值有差异?

A:溶解曲线只有用染料做检测时才有,用Taqman探针等则无溶解曲线绘制过程。溶解曲线的绘制原理是内嵌染料结合在体系中所有双链DNA上(dsDNA),包括目标产物、非特异扩增产物、引物二聚体等,随着温度从低于产物溶解点缓慢上升到高于产物溶解点,产物逐渐解链,内嵌染料释出,实时仪器连续监测样本的荧光值逐渐降低,并在产物溶解点处荧光值下降最快,反应在溶解曲线上就是一个峰值;产物完全解链后,仪器监测的荧光值达到平台期。扩增产物的长度、G/C含量、pH值、离子浓度、蛋白残留物等均会影响峰值。对于同一引物扩增不同模板,一般认为峰值相差±1℃时可以忽略不计,否则考虑引物、模板等有问题,需更新重做实验。对于不同引物,若为单峰,则不必考虑峰值差别的影响。

Q:实验所用的酶和其他试剂是否有特殊要求?

A:引物对于酶、其他试剂、仪器等没有特殊的要求,唯一的要求是在相同的条件下进行实验,如用相同的仪器,相同的试剂,相同的程序等。不同厂家的试剂、同一厂家不同批次的试剂、不同的仪器等做出来的结果在扩增曲线,及溶解曲线可能会稍有差异,但这对于相对定量没有影响。 对于不同厂家的试剂或者不同的仪器,建议做一个预实验先摸索我们推荐的反应体系及程序是否可用,如果结果不理想,可根据试剂说明、仪器参数设置原则等做适当调整。

Q:PCR扩增效率低?

A:理论上说,PCR扩增效率接近100%是最理想的扩增效率,但实际操作时,反应的扩增效率应该在90%-110%之间,扩增效率的计算公式为:扩增效率E=10-1/斜率-1,其中斜率为标准曲线的斜率,其范围应该在:-3.1至-3.5。如果扩增效率低,可能的原因是PCR反应中存在PCR酶抑制剂、PCR染料失效、引物设计不当、反应条件未优化等;扩增效率大于100%时,可能的原因是系列稀释样品时的计算或者加样错误、有非特异扩增产物、或者有引物二聚体产生等。

Q:PCR过程设置的对照及反应的问题?

A:阳性对照:一般用RNA反转录的cDNA做模板,检测看家基因,如β-Actin、GAPDH等。目的是检测反转录及PCR过程中反应体系配置、仪器等参数的设置及操作过程有无问题。或者用用质粒做模板,定量PCR定量扩增克隆产物,检测PCR反应体系及操作过程的有无问题。 阴性对照:用水做做模板阴性对照,检测反应体系所用试剂有无污染。用RNA做模板阴性对照,检测抽提RNA过程有无DNA污染。 内参检测:可检测β-Actin、GAPDH等看家基因的表达,以作内参。

Q:对于Bulge-Loop,qRT-PCR Primer中RT反应有没有特殊要求?

A:并无特殊要求,普通的试剂盒即可进行RT反应,实验时将试剂盒的RT primer 换成Bulge-Loop™ RT primer即可。具体的实验信息参阅所使用的RT试剂的操作说明。

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