高通量测序样品处理推荐流程

1.1 DNA样品的处理

1.1.1 新鲜或冷冻保存组织：≥500mg/样品。（注：不同类型的样品产量差别较大，具体送样量以达到DNA样品要求为准。）

新鲜剥离样品，快速清洗，分割

(1) 对于进行DNA提取的样品，须置于无DNase器皿中，速冻存于-20℃以下。

提前冰上预冷生理盐水或PBS；

从活体切取所需组织，置于冰上平皿内；加入预冷的生理盐水或PBS至淹没组织，漂洗去除血渍污物，重复1次；

用滤纸吸干样品表面液滴，剪成约0.3cm左右的小块；

液氮速冻后用封口膜封口（组织离体后至液氮速冻，操作时间不宜超过3min）。

(2) 运输方式：干冰运输或冷链运输。

1.1.2 贴壁或悬浮细胞：≥1×107细胞/样品。（注：不同类型的细胞产量差别较大，具体送样量以达到DNA样品要求为准。）

(1) 对于进行DNA提取的样品，须速冻存于-20℃以下。冰上预冷PBS（器皿、移液器枪头、离心管等无DNase）；

a) 贴壁细胞：用胰酶处理细胞后，进行离心收集，最后用预冷的PBS缓冲液洗涤一次，去除PBS，液氮速冻。

b) 悬浮细胞：离心收集细胞，弃培养液，用预冷PBS漂洗一次，液氮速冻。

液氮速冻后用封口膜封口。

(2) 运输方式：干冰运输或冷链运输。

1.1.3 微生物：>50mg（注：不同类型的样品产量差别较大，具体送样量以达到质检要求为准。）

(1) 建议选取处于对数生长期的菌液，高速离心收集菌体后，弃上清后菌体于液氮速冻后用封口膜封口。

(2) 运输方式：干冰运输或冷链运输。

1.1.4 血液：>2ml （注：具体送样量以达到DNA样品要求为准。）

(1) 用EDTA抗凝管采集新鲜血液混匀，须速冻存于-20℃以下。

(2) 运输方式：干冰运输或冷链运输。

注：推荐客户分装备份所有寄送样品，以便用于样品检测不合格时分析原因。

1.2 RNA样品的处理

1.2.1 ≥350mg组织/样品。（注：不同类型的样品RNA产量差别较大，具体送样量以达到质检要求为准。）

新鲜剥离样品，快速清洗，分割，

(1) 对于进行RNA提取的样品，推荐处理方法如下：

提前冰上预冷生理盐水或PBS（所用溶液需用DEPC处理过的水配制，器皿无DNase及RNase）；

从活体切取所需组织，置于冰上平皿内；加入预冷的生理盐水或PBS至淹没组织，漂洗去除血渍污物，重复1次；

用滤纸吸干样品表面液滴，剪成约0.3cm左右的小块；

a) 无保护液：剪碎的组织样品直接液氮速冻用封口膜封口（组织离体后至液氮速冻，操作时间不宜超过3min）。

b) RNAlater：放入加有5倍体积RNAlater的离心管或冻存管中（RNAlater需在4°C下过夜以允许溶液渗透进组织）；液氮速冻后用封口膜封口（组织离体后至液氮速冻，操作时间不宜超过3min）。

(2) 运输方式：干冰运输。

1.2.2 贴壁或悬浮细胞：≥5×106细胞/样品。（注：不同类型的细胞产量差别较大，具体送样量以达到RNA样品要求为准。）

(1) 对于进行RNA提取的样品，推荐处理方法如下：

RNA提取操作前，将实验器材高温高压灭菌，如果条件允许建议使用RNase清除剂仔细擦拭超净台台面、操作器材表面，清除外源性RNase，避免RNA降解。实验过程中尽量戴两付PE手套，接触操作台以外物品后更换外层PE手套。

冰上预冷PBS（用DEPC处理过的水配制，器皿、移液器枪头、离心管等无DNase及RNase）；

a) 贴壁细胞：倒去培养液后，加入适量预冷PBS漂洗一次（避免大力吹洗损失细胞），按每10cm2（35mm直径平皿）培养面积加1mL TRIzol的比例加入TRIzol，反复吹打5-10次，使所有细胞充分消化至溶液澄清程度均一，转移到离心管或冻存管中；

b) 悬浮细胞：离心收集细胞，弃培养液，用预冷PBS漂洗一次，按每5×106细胞加1mL TRIzol的比例加入TRIzol，反复吹打使所有细胞充分消化，转移到离心管或冻存管中；

液氮速冻后用封口膜封口。

(2) 运输方式：干冰运输。

1.2.3 微生物：（注：不同类型的细胞产量差别较大，具体送样量以达到质检要求为准。）

(1) 建议选取处于对数生长期的菌液，高速离心收集菌体后，弃上清后菌体于液氮速冻后用封口膜封口。

(2) 运输方式：干冰运输。

1.2.4 血液：>4ml （注：根据研究需要选择相应的方法）

(1) 用EDTA抗凝管采集新鲜血液混匀，建议在2小时候内分离白细胞、PMBC细胞等细胞类型，可直接离心去上清冷冻保存，或者加入TRIzol反复吹打使所有细胞充分消化，转移到离心管或冻存管中；

液氮速冻后用封口膜封口；

(2) 用EDTA抗凝管采集新鲜血液混匀，可使用QIAamp RNA Blood Mini Kit等抽提RNA，使用方法参考产品说明书；

(3) 如不能及时处理样品，可使用RNAprotect Animal Blood Tubes收集样品，用RNeasy Protect Animal Blood Kit等抽提RNA，使用方法参考产品说明书；

(4) 运输方式：干冰运输。

注：推荐客户分装备份所有寄送样品，以便用于样品检测不合格时分析原因。

1.3. Exosomes相关样品的处理（锐博提供相关提取服务）

注意：分离exosomes前的样品不能加入TRIzol、RNAlater等试剂，干冰运输。

1.3.1 血清样品

(1) 采血后，轻轻将全血滴入洁净的EP管或者离心管；

(2) 10min内移至4℃环境静置3~4小时，可见血块析出（也可放置4℃冰箱过夜）；

(3) 1000g~2000g，20℃离心10min，可见淡黄色上清；

(4) 取出上清后，10000g，4℃离心10min，以最大程度保证血清质量。

(5) 将血清分装，送样前可冻存于-80℃。

提示：送样量最好2mL以上

1.3.2 血浆样品（不能用肝素抗凝）

(1) 用采血针和抗凝管（含 EDTA）抽取全血，轻轻混匀；

(2) 1000g~2000g，20℃离心10min，取上清；

(3) 取出上清后，10000g，4℃离心10min，以最大程度保证血浆质量。

(4) 将血浆分装，送样前可冻存于-80℃。

提示：送样量最好2mL以上

1.3.3 细胞上清

需要提前预备的实验材料：去除exosomes的血清（自己制备或购买）

(1) 细胞在含正常血清培养基中培养一定时间，当贴壁细胞密度到70%~80%，悬浮细胞密度到60%~70%时；

(2) 对于贴壁细胞，去除培养基，并用PBS清洗1~3遍；对于悬浮细胞，450g~500g水平转子（700g角转子），4℃离心10 min收集细胞；

(3) 加入新的不含外泌体的培养基或使用无血清的培养基继续培养 48h~72h ，根据细胞生长速率收集细胞上清；

(4) 步骤3获得的上清，450g~500g水平转子（或300g~700g角转子），4℃离心10 min去除残留细胞，收集细胞上清；

(5) 步骤4获得的上清，10000 g，4℃离心10min，彻底去除细胞碎片，取细胞上清（注意避免吸入细胞或细胞碎片）即可。

提示：送样量最好20mL以上

1.3.4 尿液

需要提前预备的实验材料：滤头

(1) 用15mL离心管收集尿液，最好是收集中段尿液；

(2) 尿液建议继续用0.22μm的滤头过滤除菌，收集滤液；

(3) 3000g，4℃离心10min，取上清（注意避免吸入沉淀碎片）即可；

(4) 送样前可冻存于-80℃。

提示：送样量最好40mL以上

注：可使用其它规范的分离方法，需注意差速离心的离心条件以便有效去除细胞及细胞碎片。血清，血浆，exosomes等样品属于特殊样品，提取存在风险，锐博生物不承诺提取的成功率。其他特殊样品请与销售或技术支持联系。

表1和表2分别是DNA组织送样量与RNA组织送样量

表1. DNA组织送样量