冰冻组织切片样品制备方法
组织采集后，经固定、冷冻、切片、晾片，方可进行免疫抗体标记。
1、组织的采集、固定和保存：
不同来源的组织可依据实验条件和实验目的而考虑采用不同的固定和保存方法。此处介绍几种实验室常用方法。
1)液氮冷冻法：
采取新鲜组织后，即可放入液氮中，并保存于液氮中。
2)固定法：
采取新鲜组织后，4%多聚甲醛(4%PFA)4°C 固定1小时(根据组织大小和致密程度调整固定时间)或过夜，PBS缓冲液洗三次，每次10-30min，20%蔗糖中浸泡1小时或过夜，4°C保存于20%蔗糖(含0.05%NaN3)中。
2、组织的冷冻和切片：
组织的冷冻方法可根据固定和保存条件不同而不同。使用冷冻切片机，将组织冰切成4-20μm的切片，粘贴于处理过的载玻片上，室温干燥1小时后，可进行免疫标记。或放入载片盒，-80°C密闭保存。
1)气体CO2冷冻法：
将样品置于样品台的OCT中，打开钢瓶开关，CO2气体喷出，迅速冷冻组织样品。
2)干冰冷冻法：(适合小块和致密度低的组织，如胚胎、小块组织、活检组织等)
将小组织块放入冷冻包埋模具中，调整切面位置(必要时可在体视镜下操作)后，置于干冰上(暂时无干冰，可置于-80°C)，待冷冻完全后，-80°C密闭保存。
3)直接冷冻法：
将样品直接粘着在涂有OCT的样品台上，于冰切机(箱体温度-80°C)中直接冷冻。
3、冰冻组织切片的化学荧光标记：
将冰冻组织切片从-80°C 冰箱中取出，室温放置10min, 待切片回温并干燥，PBS 10min洗去OCT，可无需Triton处理，即可进行化学荧光标记，操作步骤请参见试剂盒使用方法。
4、冰冻组织切片的免疫荧光标记：
将冰冻组织切片从-80°C 冰箱中取出，室温放置10min, 待切片回温并干燥，PBS 10min洗去OCT，可无需Triton处理，即可进行免疫抗体标记，操作步骤请参见免疫标记方法。
5、冰冻组织切片的免疫酶反应：(酶联免疫反应，在抗体作用之前或显色时组织样品需进行内源性酶抑制作用，以降低反应背景)
1)碱性磷酸酶（AP）：
密封保存的组织切片
PBS 5min
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V
含0.5%NS,1%BSA的PBS中室温封闭30min-1hr
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V
一抗（稀释过） 室温1-1.5hr或4°C 过夜
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V
PBS 10min X 3
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V
二抗-AP（稀释过） 室温1.5-2hr
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V
PBS 10min X 3
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V
显色: AP-CDS 5min X 2
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V
NBT4.5ml/ml、BCIP3.5ml/ml in AP-CDS 室温或37°C 5-30min
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V
TE 室温 10min
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V
梯度乙醇脱水
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V
二甲苯透明
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V
中性树胶封片
2)辣根过氧化物酶（HRP）：
密封保存的组织切片
PBS 5min
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V
3%H2O2.10% MeOH in PBS 室温3min
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V
PBS 5min X 3
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V
含0.5%NS,1%BSA的PBS中室温封闭30min-1hr
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V
一抗（稀释过） 室温1-1.5hr或4°C 过夜
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V
PBS 10min X 3
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V
二抗-HRP（稀释过） 室温1.5-2hr
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V
PBS 10min X 3
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V
显色: HRP-CDS室温20-30min
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V
梯度乙醇脱水
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V
二甲苯透明
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V
中性树胶封片
