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砷(As)是一种普遍存在的有毒金属,具有多种化学形式,可引起广泛的健康问题,已经引起人们的特别关注。有证据表明As暴露会引起许多致癌和非致癌的不良生物学影响,包括肝毒性、胚胎毒性、肾毒性和神经毒性。在细胞水平上,As可通过氧化应激、代谢紊乱、细胞凋亡等引发多种细胞毒性。As的遗传毒性已在体外和体内研究中得到证实,其通过DNA损伤、染色体畸变或DNA修复受损影响基因组稳定性。此外,As诱导的表观遗传修饰在改变基因调控中也起着至关重要的作用。虽然遗传变异和表观遗传失调已被证明是AS诱导的毒性事件的重要机制,但潜在的分子基础仍然不清楚。值得注意的是,抵抗有毒污染物应激反应的复杂防御调控网络仍需进一步研究。

表观遗传学的分子机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA表达。迄今为止,越来越多的研究表明,多样化的环境污染物有助于表观遗传修饰,例如颗粒物(PM)、重金属、持久性有机污染物(POPs)等。污染物的暴露可以改变基因组的功能和稳定性,并促进污染物相关疾病,特别是恶性肿瘤的发展和进展。为此,探讨污染物诱导的表观遗传变化的具体机制具有重要的意义。作为众所周知的表观遗传调控分子,EZH2(enhancer of zeste homolog 2)被称为H3K27me3的甲基转移酶,进一步导致基因沉默并表现出致癌功能。到目前为止,EZH2在污染物诱导的毒性作用中的生物学功能几乎尚未得到探索。在接触双酚A的小鼠子宫和乳腺组织中检测到EZH2的作用和异常表达。此外,已证明PM2.5可以调节EZH2的表达,从而进一步诱导A549肺细胞G2/M期阻滞。然而,尚不清楚是否还有其他分子参与As介导的表观遗传改变,特别是EZH2的表观遗传调控作用值得深入研究。

长链非编码RNAs(lncRNAs)是长度超过200个核苷酸的转录本,没有蛋白质编码功能,已被证实其可调节基因表达和蛋白质功能,以维持细胞稳态。最近的证据表明,lncRNAs参与了环境污染物相关毒理学反应和大量人类疾病。之前的研究表明,lncRNA UCA1在预防肝细胞免受As诱导的自噬依赖性细胞死亡中发挥了保护作用。

为了阐明As暴露下HepG2肝细胞中UCA1调控的EZH2引发的信号通路,中国科学院生态环境研究中心环境化学与生态毒理学国家重点实验室刘思金、高明课题组近日在Advanced Science(IF15.804)期刊发表了题为LncRNA UCA1 Antagonizes Arsenic‐Induced Cell Cycle Arrest through Destabilizing EZH2 and Facilitating NFATc2 Expression的研究成果。从表观遗传调控的角度揭示了一种新的As毒性促生存信号通路:UCA1促进EZH2的泛素化,从而上调NFATc2并进一步拮抗As诱导的细胞周期停滞。

首先,研究人员发现As处理HepG2细胞显著降低了EZH2蛋白水平,并影响了其作为组蛋白甲基转移酶的生物学功能。泛素化实验显示EZH2可通过与泛素结合而被泛素化,并且As可以通过泛素-蛋白酶体途径促进EZH2蛋白的降解。表明As可以通过促进EZH2的泛素化来减弱其稳定性。

此外,研究人员还发现As处理可显著增加G2期细胞百分比,并伴随S期细胞百分比的降低。为了进一步阐明EZH2对As诱导的细胞周期阻滞的调控作用,研究人员通过RNAi敲低实验发现,无论As处理与否,EZH2敲低后细胞周期停滞都会减弱。表明EZH2的减少在拮抗As毒性中起着至关重要的作用。

之前的研究表明,As处理可显著诱导lncRNA UCA1的产生,从而有助于拮抗As诱导的自噬通量阻滞。此外,最近报道了UCA1可以与EZH2相互作用,从而发挥其表观遗传调控功能。因此,本研究集中于揭示UCA1与EZH2调控的As诱导的细胞周期阻滞之间的相互作用。

FISH实验显示EZH2主要分布在细胞核中,UCA1在细胞核和细胞质中均有表达,说明UCA1可能与细胞核中的EZH2相互作用,从而发挥潜在的生物学功能。接着,研究人员发现UCA1过表达细胞中As诱导的细胞周期阻滞得到了改善。然后,通过RIP、RNA-Pull down、Western blot实验表明UCA1与EZH2的N端结合,并且EZH2可能与UCA1 393~742之间的核苷酸相互作用。以上结果证实了EZH2与UCA1在结构水平上的相互作用,有助于进一步阐明UCA1对EZH2的调控机制。

随后,为了找出调控As诱导的细胞毒性的分子机制,研究人员探索了EZH2和UCA1之间的关系。发现在UCA1过表达HepG2细胞中,EZH2浓度呈剂量依赖性下降,表明UCA1对EZH2蛋白的负调控。进一步的泛素化实验证实,UCA1过表达显著增加了EZH2泛素化水平,说明UCA1通过泛素-蛋白酶体途径降低EZH2的蛋白稳定性,从而导致EZH2的含量降低;相反,UCA1的敲降减弱了EZH2的泛素化和降解。此外,在UCA1过表达HepG2细胞中,EZH2的蛋白水平呈时间依赖性方式降低以响应As处理,并在UCA1敲低的HepG2细胞中得到缓解。以上数据再次表明,在As处理下EZH2的泛素化和降解是由UCA1介导的。

进一步的机制研究表明,细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)诱导EZH2在Thr-487位点处的磷酸化是As诱导的EZH2蛋白降解的原因,而UCA1通过增加CDK1和EZH2之间的相互作用增强了这一过程。结果,作为EZH2下游靶点的细胞周期调节因子NFATc2被上调,以抵抗AS阻滞的细胞周期进程和细胞毒性。

*本研究中,FISH实验涉及的相关产品由锐博生物提供。

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