产品
  • 产品
  • 内容
  • 购物车里没有产品
选择页面
服务热线: 400-686-0075

反义寡核苷酸(ASOs)是一种短的、化学合成的单链寡核苷酸,通过对其骨架和糖基进行修饰,可增加其稳定性、药理特性以及与靶标的结合,并通常具有较小的毒性。常用于细胞和动物体内基因功能研究以及ASO核酸药物的开发等。

经过化学修饰的ASOs可以通过多种作用机制发挥作用。例如,常见的是可以通过碱基互补配对与靶标mRNA结合,导致核酸内切酶介导的转录本敲低,从而降低有害蛋白的水平;也可以通过空间阻断剪接因子来改变pre-mRNA剪接;或者通过阻止核糖体募集来阻断mRNA翻译。此外,将ASO设计成可以与疾病发病机制相关的非编码RNAs或毒性RNAs结合的反义分子,能够大大扩展可选择靶标的数量和类型。

根据其化学性质、结合序列和靶标,单链ASOs可以通过以下几种不同的作用机制(Rinaldi C and Wood M J A, 2018.)调节基因表达或改变pre-mRNA剪接。

      1. 降解靶标

      反义寡核苷酸(ASOs)一旦与RNA结合,就会形成RNA-DNA杂合体,成为RNase H的底物,从而导致靶标mRNA的降解。研究表明,ASO的活性与RNase H水平有关,且RNase H依赖的ASO活性在细胞核和细胞质中均存在。考虑到细胞核中RNase H的水平较高,因此,核内靶标mRNAs的降解率要高于胞质(Vickers and Crooke, 2015)。

2. 抑制翻译

靶向AUG起始位点的ASOs可以在空间上阻断RNA结合蛋白复合物(如核糖体亚基)的结合,从而抑制靶标mRNA的翻译。

      3. 抑制RNA结合蛋白

      在由毒性RNA功能获得机制引起的疾病中,ASOs被设计成与非编码区的高亲和力互补结合,可以通过空间位阻阻止RNA结合蛋白的结合和隔离。

4. 剪接调控

ASO结合到内含子-外显子连接点可破坏剪接位点的稳定性,或置换或募集剪接因子,从而导致靶标外显子的跳读或内含。

5. 增加翻译活性

上游开放阅读框(uORFs)的翻译通常会抑制主开放阅读框(pORF)的表达。ASOs与uORFs结合能够增加下游ORF翻译的蛋白量。

锐博生物采用国际一流的寡核酸合成和修饰技术,可针对lncRNA/circRNA/mRNA不同序列设计高特异性ASO序列,所合成的ASO序列是经过特殊化学修饰的单链RNA&DNA杂合体,极大地提高了其在细胞及动物体内的稳定性,可同时干扰胞质和核内的靶标RNA,亦可用于体内实验。并且相对病毒载体,合成周期短,适于后续ASO核酸药的研发。

锐博生物ASO产品已被广大客户所认可与使用,相关研究成果也已发表在诸如Cell Research、Nature structural & molecular biology、Molecular Cancer、Nature Metabolism、PNAS等国际知名期刊。研究模型涵盖肿瘤发生、骨生成、乳腺癌转移、成肌分化和肌肉再生、circRNA/lncRNA转录调控、肝细胞癌、上皮性卵巢癌、卵巢癌化学耐药等。

今天,小编给大家分享一篇复旦大学肿瘤研究所吴炅课题组&黄胜林课题组近期在Molecular Cancer (IF10.679)期刊上发表的题为LINC02273 drives breast cancer metastasis by epigenetically increasing AGR2 transcription的研究论文,该研究揭示了lncRNA通过表观遗传增加AGR2转录来驱动乳腺癌转移的分子机制。而使用动物用ASO 靶向LINC02273能够显著抑制体内乳腺癌的转移,这对于开发ASO核酸药物用于治疗转移性乳腺癌具有重要的指导意义。(该研究使用到的细胞/动物用ASO由锐博生物提供)

首先,研究人员对乳腺癌患者的转移性淋巴结和原发性肿瘤进行转录组分析,鉴定了一个新的lncRNA LINC02273在淋巴结转移病灶中过表达,其位于人类染色体4q31.3内。RACE实验发现LINC02273有两个主要转录本,长度分别为1653-nt和1252-nt,这两个转录本具有共同的转录起始站点,但是1653-nt转录本的表达水平显著高于1252-nt。因此接下来的机制研究中,研究人员重点关注了LINC02273的1653-nt转录本。RNA-ISH和亚细胞分离实验显示LINC02273主要位于细胞核。

随后,对乳腺癌淋巴结转移临床样本进行了qRT-PCR检测,发现LINC02273在淋巴结转移灶和晚期转移癌患者的肿瘤中高表达。Kaplan–Meier生存分析显示高表达LINC02273与较差的无复发生存率(RFS)相关。

接下来,通过CRISPR-cas9将LINC02273敲除,结果显示LINC02273的缺失显著降低了乳腺癌细胞的迁移和侵袭,而过表达LINC02273则进一步增强了乳腺癌细胞的迁移和侵袭。此外,体内敲除LINC02273时,移植瘤的生长速度被显著抑制,肿瘤体积显著减小,肺转移明显减少。表明LINC02273在体内外均可促进乳腺癌的转移。

那么,LINC02273是如何促进乳腺癌转移的呢?RNA pull-down、免疫印迹、RIP实验显示LINC02273在乳腺癌细胞中与hnRNPL特异性相互作用。并且发现LINC02273的S3-2区域内的CA重复序列和hnRNPL的RRM1/2基序对于LINC02273和hnRNPL的相互作用是必需的。此外,当用放线菌素D阻断RNA转录时,hnRNPL的缺失使得LINC02273的半衰期明显缩短,且稳定性明显降低。表明hnRNPL结合到其S3-2区域内的CA-重复序列,可以提高LINC02273的稳定性。

研究发现hnRNPL在转移性淋巴结中的水平升高,敲低或过表达hnRNPL可抑制或增强乳腺癌细胞的迁移和侵袭,揭示hnRNPL在乳腺癌中具有促转移作用。考虑到hnRNPL对LINC02273稳定性的影响,研究人员推测hnRNPL可能通过稳定LINC02273来发挥其病理作用。进一步的实验结果证实了这一猜想,说明LINC02273在介导hnRNPL的促转移中具有重要作用。

接着,研究人员对LINC02273促进乳腺癌转移的分子机制进行了探索。通过RNA-seq、ChIRP-seq以及qPCR鉴定了182个LINC02273潜在的直接下游靶标,这些基因与癌症的发生和转移密切相关。有趣的是,研究人员发现LINC02273与AGR2和GUCY2C的启动子区域结合,这表明LINC02273对这些基因的转录具有潜在的调控作用。测序分析显示AGR2在LINC02273缺失细胞中的水平明显降低,且LIN02273结合于AGR2转录起始位点(TSS)上游1756-2150 bp。进一步的ChIP-seq发现LINC02273的敲除会导致转录激活组蛋白H3K27ac和H3K4me3的降低。表明LINC02273结合AGR2启动子区,至少部分通过增强染色质H3K4me3和H3K27ac修饰来促进AGR2的转录激活。

由于hnRNPL可以稳定LINC02273,那么hnRNPL是否通过LINC02273来调节AGR2?结果发现hnRNPL的下调显著降低了AGR2的表达,支持了AGR2受hnRNPL调控的观点。随后,在LINC02273敲除细胞中过表达LINC02273可恢复AGR2表达的下降,而过表达hnRNPL则不能。此外,LINC02273过表达后,即使在hnRNPL表达降低的细胞中,AGR2的转录也升高。然而,LINC02273可能需要hnRNPL来充分激活AGR2转录。表明hnRNPL和LINC02273协同上调乳腺癌细胞中AGR2的转录。

进一步实验发现过表达/敲低hnRNPL显著增加/降低了AGR2启动子区H3K4me3和H3K27ac修饰,但在LINC02273敲除细胞中hnRNPL不能增加H3K4me3或H3K27ac的修饰,说明hnRNPL对AGR2启动子的表观遗传调控依赖于LINC02273。有趣的是,在hnRNPL缺失的细胞中也没有观察到LINC02273过表达导致的H3K4me3和H3K27ac水平的升高。表明LINC02273和hnRNPL可以协同上调AGR2启动子区H3K27ac和H3K4me3水平,从而增强AGR2的表达,导致乳腺癌转移增加。

紧接着,研究人员对606例侵袭性乳腺癌患者的原始样本中hnRNPL、LINC02273和AGR2的表达水平进行检测发现LINC02273与AGR2和hnRNPL呈正相关。同时,hnRNPL与AGR2也呈正相关。此外,AGR2的高表达与RFS较差有关。LINC02273和AGR2低表达患者的生存获益(RFS)更为显著。上述结果有力地支持了LINC02273高表达与乳腺癌中较差的RFS相关,并且在hnRNPL-LINC02273轴下游AGR2表达的增加可能促进乳腺癌转移。

最后,由于反义寡核苷酸(ASO)药物可靶向多种RNAs而受到越来越多的关注,并在体内外得到了验证。因此,研究人员针对LINC02273设计了3个ASOs,以探讨LINC02273是否可能被ASO干扰。体外实验显示LINC02273 mRNA的表达可被ASO显著抑制,乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力也受到损害。体内实验通过尾静脉注射将10nmol ASO注射进NOD/SCID小鼠体内,每周2次。结果显示肿瘤生长明显下降、肺转移灶明显减少、肿瘤组织中LINC02273和AGR2 mRNA的表达水平降低。表明以ASO靶向LINC02273可能是一种减轻乳腺癌转移的有效治疗方法。

QQ客服
官方微信
联系电话

服务热线

400-686-0075


在线留言