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《Cell》子刊重磅成果丨锐博lncRNA FISH探针助力lncRNA调控心肌分化和心脏发生机制

2018年5月10日, Cell Stem Cell (IF:23.394) 在线发表了同济大学生命科学与技术学院康九红教授课题组题为 A Linc1405/Eomes Complex Promotes Cardiac Mesoderm Specification and Cardiogenesis 的研究成果。该研究揭示了胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中lincRNA1405通过联合转录因子以及表观修饰分子,实现精确调控下游心肌特化关键转录因子表达的重要机制。

研究背景

LncRNAs已经成为不同生物过程的关键调控因子,并且可以通过多种机制调节基因表达。重要的是,组织特异性lncRNA表达模式赋予了lncRNA在胚胎干细胞(ESC)的谱系特异性分化过程中具有潜在的关键作用。最近,lncRNA已被证明参与细胞命运决定,特别是心脏谱系特化。但对lncRNAs在心脏谱系中作用的了解仍然有限。

心脏发育是一个多步骤的过程,取决于对网络的精确控制,包括多种心脏特异性转录因子、染色质修饰因子和信号通路。T-box转录因子Eomes缺失显著损害中内胚层分化,包括心脏中胚层特化。然而,Eomes如何参与特定的心肌分化尚不清楚。先前的研究表明Eomes通过直接结合Mesp1基因的启动子来诱导Mesp1表达。但是Eomes在心脏中胚层特化期间诱导Mesp1表达的精确调控机制仍然不清楚。

●  Linc1405敲降抑制小鼠ESCs的心肌分化
●  Linc140的第2外显子与Eomes结合驱动心脏谱系定型
●  Linc1405在Mesp1增强子上调节Eomes/WDR5/GCN5复合物
●  Linc1405缺失阻碍心脏发育和体内功能

主要研究结果

本研究鉴定了一个转录于中胚层Eomes基因邻近区域的基因间长链非编码RNA linc1405,FISH分析显示其在胚胎心脏中高表达(LncRNA FISH probe及全系列试剂盒由锐博生物提供)。功能缺失性/获得性实验显示linc1405缺失显著抑制了ESC的心肌分化,包括心肌标志物表达减少以及自发搏动的EBs和cTnT+ CMs的百分比降低。linc1405过表达则得到相反的结果,且在EB和CM分化中,通过linc1405过表达可显著挽救linc1405缺失导致的心肌标志物mRNA水平和cTnT+细胞比例的降低。

通过微阵列分析显示,linc1405敲降MES细胞中鉴定了65个上调基因和124个下调基因。下调的基因主要分为转录因子和DNA结合蛋白,主要与多细胞组织发育和细胞分化有关。DEG分析显示,在linc1405敲降CM细胞中鉴定了189个上调基因和261个下调基因。主要与特化模式、肌肉组织发育和心脏发育有关。并且DEGs与不同的心肌疾病密切相关。表明linc1405在调节心肌分化的核心网络过程中起着关键作用。

通过染色质和RNA免疫沉淀试验表明,linc1405介导了组蛋白甲基化修饰复合物TrxG组分WDR5和组蛋白乙酰化酶GCN5形成新型的转录调控复合物结合到Eomes下游Mesp1基因的增强子区,引起Mesp1基因增强子区域表观修饰环境(包括组蛋白甲基化和乙酰化水平)的改变,进而影响转录起始复合物在Mesp1基因转录起始位点的组装,并在胚胎干细胞的心脏中胚层特化期间激活Mesp1的表达。

此外,免疫共沉淀及荧光素酶报告基因显示linc1405的第2个外显子是其介导转录因子Eomes和组蛋白修饰分子相互作用,并识别Mesp1基因增强子区,进而调节Mesp1表达和心肌细胞分化的关键功能片段。

重要的是,FISH分析显示linc1405在E7.5胚胎的原条区域中表达,WDR5和GCN5在原条区域中与Eomes共表达(LncRNA FISH probe及全系列试剂盒由锐博生物提供)。这些结果表明linc1405和Eomes、WDR5和GCN5在原条区域共定位。通过构建linc1405敲除小鼠,发现与WT小鼠相比,敲除小鼠的室间隔(IVS)和左心室壁(LVW)的厚度更薄;此外,敲除小鼠的心脏射血分数百分比(EF%)、左室短轴缩短率(FS%)和心肌厚度(IVS和左心室后壁[LVPW])显著降低,表明linc1405缺失导致心脏发育和功能受损。

因此,提出了研究人员提出了一种整合的转录调控模型,其中linc1405通过联合WDR5和GCN5(对于心脏发生至关重要)介导Eomes在原条区域中激活Mesp1表达的不同作用。总之,linc1405介导的Eomes/WDR5/GCN5复合物有助于心脏发生,强调了基于lincRNA的复合物在体外和体内心脏发生的表观遗传调节中的关键作用。

本研究中FISH实验使用的Fluorescent In Situ Hybridization Kit,lncRNA FISH probes,Mouse U6 FISH probes,Mouse 18S FISH probes等均有锐博生物提供。

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