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抗血管生成治疗是非小细胞肺癌(NSCLC)的一种十分有前景的治疗策略,但由于具有高风险的不良反应,其在肺鳞状细胞癌(SQC)中的应用受到限制。越来越多的证据表明,长链非编码RNAs(lncRNAs)通过参与调控NSCLC中的VEGF来介导肿瘤的进展,这可能会指导新的抗血管生成策略的开发。

2020年5月30日,江门市中心医院(中山大学附属江门医院)黄炎明、张鑫等在Molecular Cancer期刊发表了题为LINC00173.v1 promotes angiogenesis and progression of lung squamous cell carcinoma by sponging miR-511-5p to regulate VEGFA expression的研究论文,阐明了LINC00173促进血管内皮细胞增殖、迁移和SQC肿瘤发生的潜在机制,证明LINC00173靶向药物联合顺铂可能是治疗SQC的合理方案。

研究流程:

1、鉴定肺鳞癌中特异性过表达的lncRNA:生信分析(表达谱数据、TCGA数据)、RT-PCR等

2、过表达lncRNA临床相关性研究:ISH、Kaplan-Meier生存分析等

3、LncRNA体内外功能研究:shRNA、基因集富集分析(GSEA)、鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验、H&E染色、RT-PCR和ELISA等

4、LncRNA作为ceRNA促进肺鳞癌血管生成和进展的机制研究:核质分离、TCGA数据集分析、miRanda algorithms、RT-PCR、RIP、荧光素酶报告基因实验、agomir、antagomir等

5、LINC00173.v1抑制对体内SQC的治疗效果研究:ASO等

6、确定LINC00173.v1在SQC中过表达的驱动因子:TCGA数据集分析、免疫组化、ChIP实验、荧光素酶报告基因实验、UCSC生物信息学分析、JASPAR2018 algorithms等

以上生信分析/数据库挖掘(表达谱数据、TCGA数据、Kaplan-Meier生存分析、基因集富集分析等)、荧光素酶报告基因实验、shRNA、agomir、antagomir、ASO、核质分离、RT-PCR等涉及的产品或服务锐博生物均可提供,欢迎咨询订购!

 研究结果:  

1、LINC00173.v1在肺鳞癌中特异性过表达

为了鉴定肺鳞癌特异性相关lncRNAs,研究人员首先分析了先前基于AE-meta的肺癌表达谱数据和TCGA数据集,发现LINC00173在SQC中特异性过表达。并通过UCSC genome browser鉴定出两个具有完全不同外显子序列的LINC00173转录本(LINC00173.v1和LINC00173.v2),其在SQC中的表达均显著上调。

随后,研究人员基于LINC00173.v1和LINC00173.v2在TCGA肺癌数据集中的reads进一步分析它们的RSEM百分比,以确定LINC00173在肺癌中的主要亚型,结果发现LINC00173.v1的RSEM百分比要高于LINC00173.v2。此外,RT-PCR分析显示LINC00173.v1在肺癌组织和细胞系中的ΔCt参考值低于LINC00173.v2。表明LINC00173.v1主要在肺癌组织中表达,并在SQC组织中特异性上调。

 

2、LINC00173.v1过表达与SQC的复发和转移有关

为进一步研究LINC00173.v1在肺癌中的临床意义,研究人员使用ISH检测了多种肺癌亚型中LINC00173.v1的表达水平。发现LINC00173.v1主要在细胞质中表达,且在SQC组织中强烈上调,值得注意的是在62.5% SQC组织中都观察到高表达的LINC00173.v1。Kaplan-Meier生存分析显示LINC00173.v1高表达的SQC患者的无进展生存期(PFS)、总生存期(OS)、无局部复发生存率(LRFS)和无远处转移生存率(DMFS)较差。表明LINC00173.v1过表达有助于SQC患者早期复发和转移。

3、沉默LINC00173.v1抑制血管内皮细胞的增殖和迁移

为了进一步研究LINC00173.v1的生物学功能,研究人员首先通过敲低肺癌细胞中的LINC00173.v1证实其并不影响体外肺癌细胞的增殖和迁移能力。然后,基于TCGA中的LINC00173.v1表达数据进行基因集富集分析(GSEA),发现LINC00173.v1表达水平与血管内皮细胞增殖和迁移相关(血管生成相关)的基因呈密切正相关。

接下来,研究人员试图探索LINC00173.v1对肺癌细胞中血管内皮细胞增殖和迁移的影响。发现LINC00173过表达不仅促进了人脐静脉内皮细胞(HUVECs)网状结构的形成,而且增强了HUVECs的迁移能力;沉默LINC00173.v1则产生相反的结果。鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验显示过表达/沉默LINC00173.v1可增加/缩短CAM培养的肺癌细胞第2和3血管长度,进一步证实了LINC00173.v1的血管生成作用。此外,RT-PCR和ELISA分析显示血管内皮细胞增殖和迁移相关基因VEGF-A与LINC00173表达的变化明显相关。表明沉默LINC00173.v1通过影响VEGFA的表达来抑制血管内皮细胞的增殖和迁移。

4、沉默LINC00173.v1抑制肺癌细胞的肿瘤发生

为了确定LINC00173.v1对体内肿瘤发生的作用,研究人员将LINC00173.v1沉默的肺癌细胞注射到小鼠体内,发现肿瘤的重量和体积减少、肿瘤坏死面积增加、淋巴或血管密度降低(CD31+ LBV);而上调LINC00173.v1则产生相反的效果。

接下来,研究人员进一步研究了LINC00173.v1对肺部肺癌细胞致瘤能力的影响。发现沉默LINC00173.v1可以显著抑制NCI-H520细胞在肺中的生长,表现为癌细胞数量减少、肿瘤坏死面积增加和累积生存期延长。而上调LINC00173.v1可以增加癌细胞的数量、减少小鼠的肿瘤坏死面积和累积生存期。表明沉默LINC00173.v1可以在体内抑制肺癌细胞的肿瘤发生。

5、LINC00173.v1充当miR-511-5p的竞争性内源RNA

核质分离和ISH实验显示LINC00173.v1主要在细胞质中表达,表明LINC00173.v1可能以ceRNA的方式在肺癌中发挥其功能。因此,研究人员通过TCGA肺癌数据集和RT-qPCR分析发现有6个miRNAs表达水平与LINC00173.v1负相关,并且在SQC组织中下调,但其中仅有miR-511-5p的表达水平可被野生型LINC00173.v1的表达变化显著影响。使用miRanda algorithms进一步支持了只有miR-511-5p在LINC00173.v1上具有潜在识别序列。

接着,研究人员通过RIP证实miR-511-5p在LINC00173.v1转录本直接相关。荧光素酶检测发现上调/沉默miR-511-5p可抑制/增强LINC00173.v1的荧光素酶报告基因活性,而不是突变体LINC00173.v1。重要的是agomir-511-5p(由锐博生物提供)可消除LINC00173.v1过表达诱导的血管内皮细胞增殖和迁移,而antagomir-511-5p(由锐博生物提供)可逆转LINC00173.v1下调对血管内皮细胞增殖和迁移的抑制作用。表明LINC00173.v1通过充当miR-511-5p的ceRNA来促进血管内皮细胞的增殖和迁移。

6、miR-511-5p/VEGFA轴对于LINC00173.v1诱导体内肿瘤发生至关重要

通过miRanda algorithms分析、RT-qPCR、RIP实验、荧光素酶报告基因试验,研究人员确定了VEGFA是miR-511-5p的真实靶点。为了进一步探索miR-511-5p/VEGFA轴在LINC00173.v1的促肿瘤作用中的功能意义,研究人员将贝伐单抗(一种重组VEGF单克隆抗体)首次用于小鼠异种移植模型。结果发现贝伐单抗显著抑制了LINC00173.v1过表达肺癌细胞形成的肿瘤重量和体积的生长。由于miR-511-5p直接靶向VEGFA,因此如预期的那样,agomir-511-5p有效抑制了LINC00173.v1过表达肺癌细胞的致瘤能力,甚至达到了与贝伐单抗治疗相当的水平。另一方面,突变的LINC00173.v1过表达肺癌细胞形成的小鼠肿瘤要比野生型形成的更小、更轻。此外,用贝伐单抗、agomir-511-5p(由锐博生物提供)处理以及接种LINC00173.v1过表达肺癌细胞的小鼠肿瘤组织中的CD31+ LBV密度差异性下调。表明LINC00173.v1通过miR-511-5p/VEGFA信号轴促进肺癌细胞的肿瘤发生。

7、LINC00173.v1抑制对体内SQC的治疗作用

为了研究内源性LINC00173.v1在体内SQC细胞肿瘤发生中的病理生理功能,研究人员使用靶向LINC00173.v1的ASO注射到小鼠体内。发现肺肿瘤生长被抑制,表现为癌细胞数量减少和累积生存期延长。在肺癌的临床治疗中,抗血管生成治疗一般与化疗药物如顺铂联合使用,因此,研究人员进一步评估LINC00173.v1 ASO与顺铂的治疗效果。结果发现,向顺铂治疗小鼠注射LINC00173.v1 ASO可以极大地促进顺铂对肺癌细胞所致肿瘤病灶的治疗效果,甚至与贝伐单抗和顺铂联合的治疗效果相当,这表明LINC00173.v1抑制可能是治疗SQC有效的治疗策略。

8、ΔNp63α有助于LINC00173.v1在SQC中过表达

对TCGA肺癌数据集的分析显示,随着鳞状细胞癌特异性因子ΔNp63α的表达水平从低、中到高增加,SQC组织中LINC00173.v1表达水平逐渐升高,表明ΔNp63α可能是SQC组织中LINC00173.v1特异性过表达的原因。因此,研究人员首先通过免疫组化发现ΔNp63α定位于细胞核,且在SQC组织中高表达。重要的是,在LINC00173.v1高水平的SQC组织中,ΔNp63α表达阳性染色的百分比为100%。RT-PCR进一步证实了上调ΔNp63可增加LINC00173.v1的表达。

接下来,研究人员通过UCSC生物信息学分析和JASPAR2018 algorithms,在LINC00173.v1的假定启动子区域中发现了5个ΔNp63α结合motifs。ChIP分析显示ΔNp63α对肺癌细胞LINC00173.v1启动子区域中的P2和P4结合位点具有高亲和力。荧光素酶报告基因实验显示ΔNp63α过表达肺癌细胞中LINC00173.v1启动子的荧光素酶活性增强,但是LINC00173.v1启动子的荧光素酶活性会因P2或P4的突变而降低,但当P2和P4的结合位点均发生突变时,不会受到ΔNp63α的明显影响。表明ΔNp63α通过调节转录有助于SQC组织中的LINC00173.v1过表达。

综上所述,这些发现支持这样的观点,即鳞状细胞癌特异性因子ΔNp63α有助于SQC组织中LINC00173.v1的过表达,LINC00173.v1通过充当miR-511-5p海绵调节VEGFA表达从而进一步促进血管内皮细胞的增殖和迁移以及肺鳞状细胞癌的发展。

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