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乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤之一。尽管在诊断和联合治疗方面取得了进展,但乳腺癌患者的预后仍然不令人满意。转移是癌症相关死亡的主要原因之一,这极大地阻碍了治疗的成功。因此,更全面地了解乳腺癌的进展和转移机制,对于改善乳腺癌患者的预后具有重要意义。

近年来,研究人员发现长链非编码RNAs参与了各种生理和病理过程,特别是在癌症中。LncRNAs是具有200多个核苷酸的转录本,没有蛋白质编码潜能。已被证实lncRNAs在癌症中经常失调,并参与多种恶性肿瘤的进展和转移。LncRNA ANCR被发现可介导EZH2的降解,从而减弱乳腺癌的转移能力。此外,发现lncRNA AGAP2-AS1在乳腺癌中被上调,并与曲妥珠单抗耐药有关。然而,绝大多数lncRNAs在乳腺癌调控中的临床意义和生物学机制仍然未知。

多项研究表明,LncRNAs可能作为ceRNAs发挥调节microRNAs生物学功能或表达的作用。例如,lncRNA LINC00963通过在乳腺癌细胞中充当miR-324-3p的ceRNA来促进肿瘤发生和抗辐射性。LncRNA NONHSAT101069通过有效充当miR-129-5p的ceRNA,从而调节Twist1的抑制作用,促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭,以及对表柔比星的耐药性。之前的研究表明,缺氧是肿瘤微环境的主要标志之一,与许多实体肿瘤的进展和转移有关。HIF-1α是一个广泛研究的缺氧诱导因子(HIF),通过下游靶基因的反式激活介导细胞对缺氧的反应。在常氧条件下,HIF-1α受到蛋白酶体降解,而低氧条件下则保护HIF-1α不被降解,从而使HIF-1α易位到细胞核中以启动基因表达。近年来,低氧条件在调节lncRNAs表达中的作用已受到广泛关注,并且各种缺氧反应性lncRNAs在肿瘤发生和肿瘤进展中起重要作用。然而,在缺氧介导异常lncRNA表达的机制以及lncRNA在乳腺癌中的功能方面还有待进一步研究。

为了解决以上科学问题,山东大学齐鲁医院杨其峰教授课题组近日在Molecular Cancer(IF10.679)期刊上发表了题为LncRNA BCRT1 promotes breast cancer progression by targeting miR-1303/PTBP3 axis的研究论文。揭示了LncRNA BCRT1通过靶向miR-1303/PTBP3轴促进乳腺癌进展的作用机制,为乳腺癌的转移机制提供了新的见解。暗示lncRNA BCRT1可能是乳腺癌的潜在生物标志物和治疗靶标。

文章的大致研究思路是这样的:

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首先,研究者使用GSE112848和TCGA公共数据库分析lncRNA表达谱以鉴定可能参与乳腺癌进展的重要lncRNAs,并且主要关注上调的lncRNAs,因为这些lncRNAs可能作为治疗靶点或预后生物标志物。结果发现lncRNA BCRT1是乳腺癌组织中显著上调的lncRNAs之一,没有蛋白编码潜能。RT-PCR进一步验证发现lncRNA BCRT1在乳腺癌组织中明显过表达。此外,高表达lncRNA BCRT1与较短的无病生存期(DFS)和总生存期(OS)显著相关。核质分离实验和FISH实验显示lncRNA BCRT1主要位于细胞质。

体内外功能实验发现敲低lncRNA BCRT1可显著降低乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;而过表达lncRNA BCRT1则显著增加乳腺癌细胞的增殖和克隆形成,并显著增加体内肿瘤的大小和体积,以及肺转移病灶的体积和数量。表明lncRNA BCRT1对于促进乳腺癌的增殖和肿瘤转移具有重要作用。

由于lncRNA BCRT1主要分布在细胞胞质中,研究者推测lncRNA BCRT1可能充当miRNA海绵,阻止miRNA与其靶mRNA结合,并通过RegRNA数据库预测、荧光素酶报告基因分析、RIP实验证实了miR-1303是lncRNA BCRT1的潜在靶点。

接着,研究者探索了miR-1303在乳腺癌中的作用。发现转染miR-1303 mimics可降低乳腺癌细胞的增值、迁移和侵袭,增加细胞凋亡。重要的是,拯救实验进一步验证了lncRNA BCRT1与miR-1303之间的功能关系。

随后,通过miRDB、miRWalk、miRPathDB和TargetScan数据库,研究者发现PTBP3是miR-1303的潜在靶标,并且使用TCGA和GEO数据库发现PTBP3在乳腺癌组织中的表达升高,而高表达PTBP3与乳腺癌患者预后不良相关。此外,PTBP3在乳腺癌细胞中的表达与lncRNA BCRT1的表达呈正相关,过表达miR-1303或敲低lncRNA BCRT1可降低PTBP3 mRNA和蛋白水平。挽救实验中,过表达miR-1303可以部分抵消lncRNA BCRT1过表达引起的乳腺癌细胞中PTBP3表达的增加。进一步的荧光素酶报告基因实验证实了PTBP3是miR-1303的直接靶点。

为了确定PTBP3在乳腺癌中的作用,研究者敲低PTBP3发现乳腺癌细胞增殖显著被抑制,细胞凋亡增加,此外乳腺癌细胞的迁移和侵袭减弱。表明PTBP3在乳腺癌中起着肿瘤启动子的作用,并且lncRNA BCRT1通过调节miR-1303对PTBP3的表达起到了重要的调控作用。

为了确定lncRNA BCRT1是否有助于M2极化,研究者检测了lncRNA BCRT1在非极化巨噬细胞、M1巨噬细胞和M2巨噬细胞中的表达。发现lncRNA BCRT1在M2巨噬细胞中表达升高,暗示了lncRNA BCRT1在巨噬细胞极化中的潜在作用。另外,敲低lncRNA BCRT1可导致M2标记物显著降低;而过表达lncRNA BCRT1则得到相反的结果,并且lncRNA BCRT1过表达乳腺癌细胞的上清液也会导致M2标记物的表达升高。

然后,研究者试图探究乳腺癌细胞和巨噬细胞之间的通讯调节机制。由于许多研究报道了lncRNAs可以通过外泌体转移调节肿瘤微环境。因此研究者从乳腺癌细胞培养上清中提取外泌体,以确定lncRNA BCRT1是否能被外泌体包裹。结果发现在乳腺癌细胞中LncRNA BCRT1过表达会导致分泌的外泌体中LncRNA BCRT1水平升高,而LncRNA BCRT1敲低则产生相反的结果,说明外泌体中存在lncRNA BCRT1。随后,对乳腺癌细胞来源的外泌体进行标记,并与巨噬细胞一起培养,证实了标记的外泌体RNAs可被巨噬细胞吸收。接着,将lncRNA BCRT1过表达细胞分离的外泌体与未极化的巨噬细胞共培养,发现lncRNA BCRT1和M2表型标志物表达显著升高,暗示外泌体lncRNA BCRT1促进了M2极化。此外,lncRNA BCRT1过表达细胞分离的外泌体或上清液处理巨噬细胞显著促进了细胞迁移和血管生成。以上结果表明lncRNA BCRT1可以通过外泌体转移,从而促进M2表型极化并增强其肿瘤促进功能。

接下来,为了研究lncRNA BCRT1是否为缺氧敏感的lncRNA,研究者对乳腺癌细胞进行了缺氧或常氧处理。结果发现随着HIF-1α表达的增加,lncRNA BCRT1的表达明显升高。而敲低HIF-1α极大地减弱了缺氧诱导的lncRNA BCRT1上调。为了阐明缺氧诱导lncRNA BCRT1上调的潜在机制,研究者分析了JASPAR数据库,在lncRNA BCRT1启动子中鉴定出两个假定的HIF-1α反应元件(HRE),并通过荧光素酶报告基因实验证实了HRE1对lncRNA BCRT1的转录至关重要。ChIP实验进一步证实了HIF-1α与lncRNA BCRT1启动子中的两个预测HRE结合,并且lncRNA BCRT1启动子中的HRE1是介导HIF-1α诱导的转录调控的主要区域。以上结果表明缺氧是通过HIF-1α与lncRNA BCRT1启动子上的HRE1直接结合从而转录调控lncRNA BCRT1的表达。

缺氧是肿瘤微环境的一个标志,与各种实体肿瘤的增殖、转移和耐药有关。因此,研究者需要确定lncRNA BCRT1是否参与了缺氧诱导的细胞增殖。结果发现缺氧处理导致lncRNA BCRT1和PTBP3表达增加,与细胞增殖增强一致。敲低HIF-1α或lncRNA BCRT1减弱了缺氧诱导的作用,而过表达lncRNA BCRT1部分逆转了HIF-1α敲低的抑制作用。此外,缺氧处理后,乳腺癌细胞表现出更多成纤维细胞样形态并且迁移能力增强,而敲低HIF-1α或lncRNA BCRT1可显著逆转这一状态。另外,lncRNA BCRT1过表达明显挽救了低氧条件下siHIF-1α抑制的EMT图谱。以上结果表明,lncRNA BCRT1可能参与了缺氧诱导的乳腺癌细胞的生物学功能。

总的来说,研究结果揭示了用于乳腺癌进展的新的HIF-1α/ lncRNA BCRT1 / miR-1303 / PTBP3途径,并表明lncRNA BCRT1可能是乳腺癌的潜在生物标志物和治疗靶标。

*本研究细胞增殖实验所使用的EdU产品由锐博生物提供!

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