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Nature子刊丨锐博m6A-seq整体服务助力m6A修饰调控免疫机制的发现

N6-甲基腺苷(m6A)修饰通过调节mRNA生物学在细胞反应中发挥重要作用,那么m6A修饰如何通过影响免疫转录本的翻译而参与先天免疫的呢?2019年4月23日,中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所曹雪涛院士课题组在Nature Communications发表了题为Mettl3-mediated mRNA m6A methylation promotes dendritic cell activation的文章,首次揭示RNA甲基转移酶Mettl3介导的mRNA m6A甲基化促进树突细胞(DC)功能活化,对于深入理解RNA表观修饰调控免疫基因表达的机制,进一步阐明m6A修饰在免疫应答及炎症反应中的功能具有重要意义。

研究背景  

m6A是哺乳动物mRNA中最常见的转录后修饰。最近研究表明,m6A修饰通过介导RNA衰变调节多种生物途径,例如干细胞分化、肿瘤发生和病毒复制。然而,m6A修饰在免疫调控中的作用尚不清楚。树突细胞(DC)是连接先天性和适应性免疫应答的抗原呈递细胞(APC)。虽然已经深入研究了调控DC发育和功能的转录网络,但表观遗传机制(特别是mRNA m6A修饰)在该过程中的作用还不清楚。因此,确定m6A甲基化在控制DC活化中的作用对于更好地理解免疫应答是至关重要的,也将具有重要的临床意义。

 研究结果 

1、m6A修饰水平在DC成熟期间升高

研究人员利用DC成熟和分化模型,包括骨髓来源的imDC(未成熟DC)、LPS刺激的BMDC(maDC:成熟DC)和DCreg(调控DC),来研究m6A修饰在DC的成熟和功能中的表达模式和生物学作用。发现与imDC和DCreg相比,maDC中m6A修饰水平显著升高。随着m6A修饰水平的动态变化,m6A甲基转移酶Mettl3、Mettl14和Wtap在maDC中也升高。

然后对imDC、maDC和DCreg样本进行meRIP-seq分析转录组水平的mRNA m6A修饰(meRIP-seq整体服务由锐博生物RiboBio提供),发现高置信度的m6A峰分别在imDC、maDC和DCreg的6004、7990和6624个基因转录本中富集,并且这些m6A峰具有共同的序列元件GGACU。在DC中,m6A在转录起始位点和终止密码子位点附近达到峰值。而随着maDC中m6A水平的升高,m6A峰在更多的maDC转录本中富集,通过GO富集分析表明这些转录本在免疫系统和炎症反应中富集。

2、Mettl3以m6A催化活性依赖性方式促进DC成熟

m6A修饰由RNA甲基转移酶复合物催化,而Mettl3是主要的催化亚基。为了进一步探讨m6A在DC成熟和功能中的作用,研究人员在DC中特异性缺失Mettl3(Mettl3KO),发现m6A水平明显下降,MHC class II (I-Ab)和共刺激分子CD86、CD80、CD40的表达也降低,并且在响应LPS刺激中损害促炎细胞因子IL-6、TNF-α和IL-12p70的产生。而重新过表达Mettl3可恢复CD86、I-Ab、CD80和CD40的表达以及IL-6、TNF-α和IL-12p70的分泌。表明Mettl3依赖于其m6A催化活性促进DC的成熟表型和促炎细胞因子分泌。

3、Mettl3以m6A催化活性依赖性方式促进T细胞活化中的DC功能

接下来,研究人员分析了Mettl3KO DC在体外和体内促进T细胞增殖的功能。发现Mettl3KO maDC可启动同种异体CD4+ T细胞增殖并且使IFN-γ产生的能力受损,通过体外过表达Mettl3可恢复该表型。体内实验也得到同样的结果。表明Mettl3在体外和体内通过其m6A催化活性对于促进T细胞增殖所需的DC功能是必需的。

4、Mettl3在DC成熟过程中增强先天反应和NF-κB信号传导

为了探索Mettl3通过m6A修饰促进DC成熟和活化的分子机制,研究人员对Mettl3KO和野生型小鼠的maDC进行RNA-seq及qPCR验证。发现Mettl3缺失导致TLR4/NF-κB通路下游效应分子,以及细胞因子IL-6和IL-12b mRNA水平的下调,并且下调的转录本富集在免疫应答,尤其是对LPS的先天性炎症反应。进一步研究发现Mettl3KO DC中所有下调基因的生命期没有差异。表明Mettl3KO DC中IL-6和IL-12 mRNA水平的降低可能是由于转录活性的降低而不是由于mRNA降解的加速。

随后,研究人员检测了NF-κB途径信号分子的蛋白质表达和磷酸化水平。发现在LPS刺激后,Mettl3KO DC显著降低信号分子TAK1、IKKα、IKKβ、ERK、JNK和NF-κB亚基p65的磷酸化水平。值得注意的是,Tirap在LPS刺激的Mettl3KO DC中具有较低的蛋白质水平,这表明Mettl3可能在DC成熟和活化期间通过Tirap促进NF-κB信号传导。

5、Mettl3促进体内Tirap、CD80和CD40 mRNA翻译

Mettl3是否通过m6A依赖性机制调控Tirap、CD80和CD40的表达?研究发现Mettl3KO DC中的Tirap mRNA水平与Mettl3WT DC中的相似,CD40和CD80在Mettl3KO DC中的mRNA水平相似,但蛋白水平降低。这三种分子(Tirap,CD40和CD80)在maDC中均进行m6A修饰,并且在Mettl3KO maDC中m6A修饰水平显著降低。随后的全基因组核糖体分析及qPCR验证发现,与Mettl3KO maDC相比,Tirap、CD80和CD40在Mettl3KO maDC中均具有较低的翻译效率。进一步的萤光素酶报告基因实验得到类似的结果。表明Mettl3介导的m6A修饰可促进Tirap、CD80和CD40的表达翻译。

6、CD40和CD80的m6A依赖性翻译增强与Ythdf1正相关

考虑到测序和核糖体分析数据,m6A reader蛋白Ythdf1是否与CD40和CD80翻译增加有关?研究人员通过IP实验发现Ythdf1与野生型CD40或CD80 mRNA的相关性分别高于其突变型,表明Ythdf1可以识别以上所分析m6A修饰的mRNAs。而敲降Ythdf1可降低Mettl3WT小鼠maDC中CD40和CD80的蛋白表达水平。表明Ythdf1在促进CD40和CD80 mRNA翻译中的作用。

总之,本研究证明了Mettl3介导的CD40,CD80和Tirap的m6A在促进DC活化和成熟中起重要作用:CD40和CD80的上调表达有助于增加DC的抗原呈递和T细胞刺激,并且 Tirap的高表达有助于增强TLR4 / NF-κB信号传导和增加促炎细胞因子的分泌。

这项成果中有关m6A-IP(免疫共沉)、文库构建及高通量测序等均委托锐博生物(RiboBio)完成。

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