产品
  • 产品
  • 内容
  • 购物车里没有产品
选择页面
服务热线: 400-686-0075

三分之一的人口超重或肥胖。流行病学研究表明,肥胖是结肠癌、乳腺癌和肝癌等恶性肿瘤的独立危险因素。例如,肥胖使罹患肝癌的几率增加了1.5-4.0倍。一项针对90万美国人进行的16年前瞻性研究发现,肥胖男性和女性的肝癌发病率分别比非肥胖人群高4.52倍和1.68倍。

在美国,新近诊断出的HCC中有高达50%是由非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)等肝代谢异常所引起的。母亲肥胖在肥胖流行和代谢性疾病中起着至关重要的作用,直接影响后代的健康。肥胖母亲的后代罹患代谢性疾病(包括NAFLD)的风险增加,与父亲的体重无关,这表明母亲因素在肥胖遗传中起主要作用。之前的研究表明,多代暴露于高脂饮食(HFD)压力的母亲的后代表现出肥胖和NAFLD评分的逐渐增加。然而,目前尚不清楚肥胖母亲的后代是否更容易发展为HCC等恶性肿瘤。

多代肥胖涉及表观遗传机制。越来越多的证据表明,非编码RNAs会在其后代中介导可遗传的表型,例如母体循环microRNAs(miRNAs)已被认为可以穿过胎盘并影响后代的表型。然而,尚未确定母亲非编码RNAs与后代疾病发展之间的联系。

2020年6月25日,武汉大学生命科学学院郑凌教授和华中科技大学同济医学院附属同济药学院黄昆教授在Journal of Hepatology(最新IF20.5852)期刊上发表了题为Multigenerational maternal obesity increases the incidence of HCC in offspring via miR-27a-3p的科研成果。报道了一个在肥胖母亲中上调的microRNA(miR-27a-3p),其可以传递给后代。这种microRNA通过调控2个基因(Acsl1和Aldh2)来增加后代患肝癌的风险。该机制可能成为未来的治疗靶点。

母体血清miR-27a-3p和肝miR-27a-3p-Acsl1/Aldh2轴在调节后代对HCC易感性中的作用

实验设计

为了研究多代HDF应激母亲的后代的HCC易感性,实验设计如下:

DEN诱导多代HFD喂养应激小鼠肝细胞癌的实验设计流程图

1. 雌性小鼠(F0代)从1个月至3个月大时接受正常食物(NC)或HFD(60%千卡脂肪)喂养,并与NC喂养的雄性小鼠交配以繁殖如先前报道的F1代。

2. F2代的产生与此类似。

3. F0、F1和F2代雄性小鼠在p15时通过腹腔注射25mg/kg的DEN(二乙基亚硝胺),并在断奶后维持HFD,分别命名为HFD1D、HFD2D和HFD3D组。

4. 同时,将相同年龄注射PBS(NC组)或DEN(NCD组)的F0代雄性小鼠(维持正常饮食)作为对照组。

5. 各组均在40周龄时被处死。HCC的发生率是通过解剖显微镜下肿瘤计数来确定的(直径2-8 mm的肿瘤称为“肿瘤”;直径> 8 mm的肿瘤称为“大肿瘤”)。收集血清、肿瘤(直径> 2 mm)和非肿瘤组织用于进一步分析。

研究结果

1、 母体多代HFD暴露会增加后代的HCC发生率

研究发现与HFD1D和NCD组相比,HFD2D和HFD3D组的存活率显著降低,且这两组之间是无差异的。与NCD和NC小鼠相比,HFD1D和HFD2D组的血清TC和TG水平显著升高,而HF3D组则进一步明显升高,表明世代HFD应激逐渐增加了后代的脂毒性。值得注意的是,在HFD喂养+DEN应激下,后代的肿瘤数量和大小一代代逐渐增加。H&E和三色染色实验也证实了HFD喂养+DEN应激导致后代的肝脏病理一代代逐渐恶化。

2、 母体多代HFD暴露会增加后代(经受HFD+DEN处理)的肝脏炎症和细胞增殖

免疫细胞浸润和肝细胞增殖增加是肝癌发展的重要特征。在HFD+DEN应激下,研究人员在未来几代后代的肝脏中发现F4/80(巨噬细胞标志物)、CD3(T细胞标志物)、Ly-6G(嗜中性粒细胞标志物)和Ki67(细胞增殖标志物)染色的肝细胞数量逐渐增加。肝损伤标志物(如血清AST和ALT)在后代中也逐渐增加。与NC小鼠相比,NCD、HFD1D和HFD2D组的血清AFP(一种HCC诊断标志物)水平升高,而在HFD3D小鼠中则进一步升高。此外,与NC小鼠相比,NCD小鼠的血清炎症标志物IL-6和TNFa28的水平升高,而HFD2D和HFD3D组则进一步升高。

3、 代谢相关基因随着世代而变化

为了探索多代母体HFD暴露是如何增加后代的HCC发生率,研究人员对肿瘤进行了RNA测序。发现不同组间基因显著改变相关的前10个KEGG通路中,大多数与代谢有关。对代谢途径中富集的基因进行进一步分析,发现这些基因大部分下调,属于脂质和/或氨基酸代谢。qPCR证实了在HFD+DEN应激下,未来几代后代肝脏中的Aldh2、Acsl1、Apoa5、Apol7a、Rbp4、Akr1c6、Acaa2、Acaa1b、Glul、Car3、Hamp和Hamp2水平逐渐降低。在这些基因中,研究人员主要关注Acsl1和Aldh2,因为在TCGA分析中,它们的水平与HCC呈显著负相关。此外,HCC患者Acsl1或Aldh2水平较低,其总体生存率较差。因此,研究人员接下来需要验证Acsl1和Aldh2是否与后代HCC发病率增加有关。

4、 敲低Acsl1和Aldh2协同促进HFD后肿瘤生长

体外实验显示对Acsl1和Aldh2进行单个敲低或同时敲低均可增加HCC细胞增殖。但与敲低单个基因相比,同时敲低可显著诱导HCC细胞增殖,表明Acsl1和Aldh2协同影响细胞增殖。为了研究敲除Ascl1或/和Aldh2是否会加剧体内肿瘤的生长,研究人员进行了皮下异种移植。异种移植前,裸鼠接受NC(正常饮食)或HFD喂养8周,HFD喂养小鼠的体重、血清TC和TG水平显著增加。

NC喂养条件下,与对照组相比,shAcsl1、shAldh2和shAcsl1+shAldh2组的肿瘤生长速度和大小/重量显著增加,且各组间无显著差异。而在HFD喂养条件下,与对照组相比,shAcsl1或shAldh2组的肿瘤生长速度和大小/重量也有所增加,但是shAcsl1 + shAldh2组的肿瘤生长速度和大小/重量进一步增加。值得注意的是,与相应的NC喂养组相比,HFD喂养组的肿瘤生长速度、大小和体重均显著增加。

5、 肝脏miRNAs随着世代而变化

研究人员通过RNA测序检查了后代肝脏中的miRNA水平。发现不同组间miRNAs显著改变的前10个KEGG通路中,大多数与癌症发展有关。热图显示了一组随着世代变化而逐渐改变的miRNAs。qPCR证实在肿瘤中,miR-210-3p、miR-223-3p、miR-222-5p、miR-322-5p、miR-34c-5p、miR-27a-3p、miR-21a-5p、miR- 486a-5p和miR-532-5p在后代中逐渐增加。TCGA分析表明,HCC患者中包括miR-27a-3p在内的5种miRNAs水平较高时,其生存率显著降低。

生物信息学分析表明miR-27a-3p可能调节Acsl1和Aldh2的转录。miR-27a-3p mimic或inhibitor处理可显著降低或增加Acsl1和Aldh2的mRNA以及蛋白水平。为了评估miR-27a-3p是否调节Acsl1或Aldh2 mRNA的转录,研究人员通过荧光素酶报告基因检测发现共转染miR-27a-3p mimic与野生型(而不是突变体)Acsl1或Aldh2的3’-UTR,大大降低了它们的转录水平,通过萤光素酶活性的降低可以证明。而miR-27a-3p inhibitor的作用相反。

为了进一步研究miR-27a-3p对肿瘤生长的影响,进行了皮下异种移植实验。HFD喂养8周的裸鼠皮下注射HepG2细胞(第0天),然后将miR-27a-3p agomir注射到肿瘤中(从第6天到第16/18天),每隔一天注射一次。发现在agomir治疗的小鼠中,肿瘤的生长速度和大小显著增加。agomir注射可显著上调miR-27a-3p以及肿瘤中Acsl1/Aldh2的mRNA和蛋白质水平。注射antagomir则效果相反。这些数据表明,miR-27a-3p调节Acsl1和Aldh2,影响HCC的发展。

6、 HFD喂养的母亲血清miR-27a-3p水平升高会影响后代HCC易感性

母体miRNAs被认为会影响胎儿表型。因此,研究人员检测了母系血清中的9个miRNAs,发现HFD应激的母系血清中的miR-27a-3p水平逐渐升高,推测母体血清miR-27a-3p水平的改变可能会影响后代肝脏miR-27a-3p及其靶基因的水平。为了验证这种猜想,研究人员将miR-27a-3p agomir注射到怀孕的C57BL/6小鼠体内,从E12.5到E18.5期间,每隔一天注射一次。发现通过提高母体血清中的miR-27a-3p水平,可显著上调胎儿和幼鼠体内的miR-27a-3p水平和下调Acsl1、Aldh2的mRNA和蛋白水平。

为了验证母体血清miR-27a-3p水平的改变是否会影响其后代的HCC易感性。研究人员将miR-27a-3p agomir注射到怀孕的C57BL/6小鼠体内,雄性后代在p15时接受DEN处理,断奶后用NC或HFD喂养。结果发现,无论饮食如何,其后代中发现的肿瘤数量均显著增加;而HFD条件下后代的肿瘤负担更重。H&E和三色染色显示后代的肝脏病变加重,而在HFD喂养的后代中发现了最显著的变化。此外,后代肝脏miR-27a-3p水平显著上调,而Acsl1和Aldh2的mRNA和蛋白水平下调。

7、 (非)脂肪肝HCC患者中miR-27a-3p与Acsl1和Aldh2呈负相关

为了研究miR-27a-3p-Acsl1/Aldh2轴在HCC中的临床相关性,研究人员获得了54例临床样本(27例脂肪肝相关HCC,27例非脂肪肝相关HCC)。检测发现Acsl1和Aldh2在肿瘤组织中的水平明显低于非肿瘤组织,脂肪肝样本中的Acsl1和Aldh2水平也明显低于非脂肪肝样本。同样地,miR-27a-3p在肿瘤组织中的水平显著高于非肿瘤组织,而在脂肪肝样本中的miR-27a-3p水平显著高于非脂肪肝样本。相关性分析进一步揭示了miR-27a-3p与Acsl1或Aldh2的表达呈负相关。

总之,该研究通过RNA测序鉴定了后代肝脏中miRNAs和基因的多代变化。并使用数据库和临床样本、肿瘤异种移植、培养细胞和小鼠模型证明了母亲肥胖通过miR-27a-3p-Acsl1/Aldh2轴在代与代之间起作用的表观遗传机制,该机制在调节肥胖母亲后代的HCC发生中具有重要作用。

本研究使用到的miRNA qPCR Starter Kit (C10712)、miRNA PCR Primer Sets、动物用产品(agomir、antagomir)、细胞用产品(mimic、inhibitor)、转染试剂盒(C10511-1)等均由锐博生物提供。

QQ客服
官方微信
联系电话

服务热线

400-686-0075


在线留言