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胃癌(Gastric cancer, GC)是全球第五大最常见诊断癌症和第三大癌症死亡原因。它威胁人类健康,其经过年龄标准化的5年净生存率从20%~40%不等。因此,研究用于GC诊断和预后的有效生物标志物以及药物治疗的靶标具有重要的医学意义。越来越多的证据证明了非编码RNAs(ncRNAs)在胃肠道恶性肿瘤中作为表观遗传调控因子的作用。环状RNAs(circRNAs)是一类通过反向剪接产生的ncRNAs,其环状结构使它们更加稳定。CircRNAs在组织中高度丰富和特异性表达,其中数千种circRNAs在肿瘤组织和正常组织中存在差异表达。单个circRNAs可以充当miRNAs海绵。miRNAs与mRNA 3’UTR结合,可在转录后沉默靶基因。除miRNAs海绵外,诸如circFoxo3和circPABPN1等circRNAs还可以通过与蛋白质相互作用来发挥作用,从而诱导癌细胞凋亡、阻断细胞周期进程并抑制细胞增殖。已经证明circRNAs稳定富集于外泌体中。外泌体是大多数细胞分泌的纳米级细胞外囊泡,内含丰富的RNA和蛋白质,可以调节细胞的生物学过程并作为各种疾病的循环生物标志物。研究表明,血清外泌体circRNA可以区分癌症患者与健康对照,并且外泌体circRNA可以成为液体活检的生物标志物。

Hu抗原R(HUR)作为ELAV家族的成员,是最有名的RNA结合蛋白(RBP)之一,可以选择性识别并结合富含腺苷酸/尿苷酸的元件(AREs)。AREs是哺乳动物细胞mRNA 3’UTR中腺苷酸尿苷酸富集区域,可介导mRNA的快速降解。HUR通过稳定其mRNA在转录后调节其靶基因,并参与细胞生长和肿瘤发生。

另一种常见的癌蛋白是热休克蛋白90(HSP90),它是一种进化上保守的分子伴侣蛋白,在应激反应中参与稳定和激活蛋白。与正常组织相比,HSP90在肿瘤中过表达,其作为遗传损伤缓冲剂的功能允许突变蛋白保留其功能,同时允许癌细胞耐受不平衡的微环境。

2020年6月29日,南京医科大学第一附属医院束永前教授课题组在Molecular Cancer(IF15.302)期刊上发表了题为Exosomal circSHKBP1 promotes gastric cancer progression via regulating the miR-582-3p/HUR/VEGF axis and suppressing HSP90 degradation的科研成果。发现circSHKBP1在GC患者的肿瘤和血清外泌体中均过表达,并且与晚期病理分期和较差的生存率相关。CircSHKBP1通过吸附miR-582-3p并诱捕HSP90来促进体内和体外的GC进程。 为GC的发病机理提供了一个新的见解。

circSHKBP1调控胃癌进展的作用示意图

研究结果

1. 通过RNA-Seq鉴定GC中的circRNAs

通过对8个GC组织和8个匹配的相邻正常组织的混合样本进行RNA-seq,研究人员总共鉴定出1445个不同的候选circRNAs,其中至少有2个独特的反向剪接连接reads。与正常组织相比,癌组织与正常组织间共有119个circRNAs差异表达,其中5个circRNAs上调,114个下调。进一步通过qRT-PCR分析了10对胃癌肿瘤和正常组织中前5个表达上调和下调的circRNAs,发现circSHKBP1是胃癌中差异表达最大的circRNA。

2. circSHKBP1的表征及其在GC中的表达

研究发现circSHKBP1是由SHKBP1基因的第11、12外显子反向剪接产生,Sanger测序和RNase R消化实验也证实了circSHKBP1以环状形式存在。随后,研究人员通过qRT-PCR检测了circSHKBP1在72个配对的GC组织和正常组织中的表达,发现与匹配的正常组织相比,circSHKBP1在53个GC组织中表达上调。此外,研究人员还对152对胃癌患者的癌组织和正常组织进行ISH检测。发现circSHKBP1在GC组织中的丰度远远高于匹配的正常组织,且circSHKBP1表达与晚期TNM分期、血管侵犯及预后不良相关。

为了确定血清外泌体中是否能检测到circSHKBP1,研究人员收集了20例GC患者和20例健康对照的血液样本,并提取血清中的外泌体。发现GC患者血清外泌体中的circSHKBP1比健康对照组更丰富。此外,血清外泌体中的circSHKBP1水平与胃癌患者肿瘤中的一致,约为肿瘤中的6倍,使得从血液样本中检测circSHKBP1的表达成为可能。同时,研究人员还检测了胃切除术前后血清外泌体中的circSHKBP1表达水平,发现肿瘤切除后circSHKBP1显著下降,提示GC组织是外泌体circSHKBP1的来源。
这些结果表明,circSHKBP1是衍生自GC组织的上调的circRNA,可以通过外泌体有效地传递到循环系统中。此外,circSHKBP1的高表达水平与晚期TNM分期和GC的预后不良有关,使其成为GC潜在的有前景的RNA生物标志物。
3. CircSHKBP1在体外促进GC细胞的增殖、迁移和侵袭

体外实验显示,使用siRNA敲低circSHKBP1可显著抑制GC细胞增殖、迁移和侵袭能力;过表达circSHKBP1则得到相反的结果。此外,研究人员发现外泌体circSHKBP1的增加是由于更多的circSHKBP1被装载到外泌体中,而不是更多的外泌体被释放。随后,将提取的转染了circSHKBP1质粒的BGC823和HGC27细胞培养液中的外泌体,与不同浓度未处理的GC细胞共培养。发现外泌体circSHKBP1的过表达也影响了GC细胞的增殖、迁移和侵袭,促进了恶性细胞的表型。

这些结果表明circSHKBP1促进了GC细胞的生长和转移,而沉默circSHKBP1的表达则抑制了GC细胞的进展。更重要的是,随着circSHKBP1在GC细胞中的异位表达,更多的circSHKBP1被加载到外泌体中,从而干扰邻近或远处GC细胞的生物学功能。
4. CircSHKBP1作为miR-582-3p的海绵

为了研究circSHKBP1在GC细胞中的作用机制。研究人员首先通过FISH和核质分离确定了circSHKBP1优先定位于GC细胞的细胞质内。又通过RIP实验证实了circSHKBP1可充当miRNA海绵的作用。接着,预测了四个与circSHKBP1结合的潜在miRNA(miR-582-3p、miR-665、miR-1207和miR-4458),并且发现在circSHKBP1过表达的GC细胞中,miR-582-3p和miR-665的表达下调。荧光素酶报告基因实验和生物素标记的RNA pulldown实验证实了circSHKBP1与miR-582-3p直接相互作用。qRT-PCR检测发现miR-582-3p在GC肿瘤中的表达水平低于配对正常组织,且miR-582-3p与circSHKBP1的表达呈负相关。表明circSHKBP1作为miR-582-3p的海绵,降低了miR-582-3p的表达。进一步的miR-582-3p生物学功能研究显示miR-582-3p mimic抑制了GC细胞的增殖、迁移和侵袭,而circSHKBP1的过表达则消除了这种抑制作用。

5. CircSHKBP1通过上调HUR促进VEGF翻译

临床数据分析显示高circSHKBP1组的血管侵犯率明显高于低circSHKBP1组。通过生物信息学分析发现了54个miR-582-3p候选靶蛋白,其中HUR和EIF2S1被报道为VEGF信号通路的一部分。VEGF是促进内皮细胞增殖的重要因素之一,因此研究人员对VEGF途径进行了深入研究。

western blot检测显示过表达circSHKBP1增加了HUR和VEGF的水平,但对EIF2S1的水平没有影响。此外,miR-582-3p mimic可降低HUR和VEGF蛋白水平的升高。同样,沉默circSHKBP1可以降低HUR和VEGF的水平,而miR-582-3p inhibitor可以恢复这些水平。HUR作为VEGF信号通路中的重要元件,可通过与VEGF mRNA的AREs结合,从而稳定mRNA结构并诱导VEGF翻译。RIP实验证实了HUR是miR-582-3p的靶点,并且HUR直接与VEGF mRNA结合。此外,还发现HUR表达与miR-582-3p负相关,与circSHKBP1正相关。

接下来,研究人员用不同浓度的贝伐单抗(一种针对VEGF的抗体)治疗circSHKBP1过表达的GC细胞,以确定circSHKBP1是否通过VEGF加速了肿瘤进展。结果显示VEGF水平随着贝伐单抗浓度的增加而降低。贝伐单抗以浓度依赖性方式减弱了GC细胞的增殖和迁移能力,并且circSHKBP1过表达细胞的抑制率比对照组高得多。进一步的小管形成实验证实了circSHKBP1可以促进VEGF分泌并诱导血管生成,而贝伐单抗可以抑制这种作用。
6. CircSHKBP1直接与HSP90相互作用并抑制其降解

使用特异性生物素标记的circSHKBP1探针进行RNA pulldown发现circSHKBP1过表达GC细胞中有多条蛋白条带富集。蛋白质谱分析用于鉴别差异表达的蛋白,排名前2位的分别是HSP90β和HSP90α蛋白(HSP90的两种亚型)。RIP实验证实了circSHKBP1与HSP90直接相互作用。TCGA分析、qRT-PCR和ELISA检测发现HSP90 mRNA和蛋白在胃癌中表达上调,且HSP90蛋白表达与circSHKBP1呈正相关。Western blotting显示circSHKBP1过表达后HSP90总量略有增加。然而,用CHX抑制蛋白质合成后,circSHKBP1过表达可显著抑制HSP90的降解。

E3泛素连接酶STUB1已被证明可以将HSP90泛素化,从而将其靶向蛋白酶体进行降解。因此,使用蛋白酶体抑制剂来阻断HSP90的泛素化可降低其降解速率。为了解释circSHKBP1是如何保护HSP90防止降解的,研究人员假设circSHKBP1和STUB1在相似位点与HSP90竞争性结合。IP检测结果显示circSHKBP1过表达降低了STUB1与HSP90的结合量。此外,HSP90的选择性抑制剂NMS-E973在体外损害了circSHKBP1的促肿瘤功能。以上结果表明circSHKBP1直接与HSP90结合,抑制了STUB1对HSP90的泛素化,从而加速了GC的发展。
7. CircSHKBP1在体内调节GC的生长和转移

为了研究CircSHKBP1在体内的功能,研究人员构建了稳定沉默circSHKBP1和稳定过表达circSHKBP1的细胞株,然后将细胞皮下接种于裸鼠右大腿,密切监测肿瘤生长。结果发现敲低circSHKBP1可限制肿瘤生长,无论是肿瘤体积还是肿瘤重量/体重比;过表达circSHKBP1使得产生的肿瘤更大、更重,而注射贝伐单抗可显著抑制肿瘤生长。通过对小鼠血清和肿瘤中的蛋白进行western blot分析,发现circSHKBP1沉默组的HUR和VEGF水平下降;circSHKBP1过表达组的HUR和VEGF升高,而贝伐单抗抑制VEGF。

此外,体内敲低circSHKBP1还可显著降低肺转移病灶的数量和大小,并且circSHKBP1的敲低导致GC肺转移病变中的HUR和VEGF明显降低。过表达circSHKBP1则加重了肺转移病灶,并且使HUR和VEGF增加,贝伐单抗可抑制circSHKBP1的转移潜力。
总之,本研究结果表明外泌体circSHKBP1调控miR-582-3p/HUR/VEGF通路,抑制HSP90降解,并促进GC进展。circSHKBP1是一种很有前景的GC诊断和预后循环生物标志物,也是进一步治疗探索的潜在候选。
本研究使用到的circRNA siRNA、miRNA mimic、inhibitor、FISH探针/试剂盒、EdU、生物素标记的mimic等产品均由锐博生物提供。欢迎从事相关科学研究的广大新老客户咨询、订购!
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