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乳腺癌是全球女性癌症相关死亡的最常见原因。三阴性乳腺癌(TNBC)是乳腺癌的一个亚群,其定义为雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)的缺失。这一亚群约占所有乳腺癌的15%~20%。TNBC的特征是细胞增殖和转移率高、预后差。主要的治疗策略是常规化疗和放疗。迄今为止,FDA尚未批准针对TNBC的靶向疗法。因此,迫切需要为TNBC寻找可行的分子靶标。

CircRNAs是共价闭合的单链环状转录本。高通量测序和生物信息学分析揭示了circRNAs在不同物种中的广泛表达。由于具有高度的稳定性、丰富和进化保守性,circRNA作为临床疾病的生物标志物具有明显的优势。已经发现circRNAs具有一系列重要的生物学功能,包括microRNA海绵、RNA结合蛋白(RBPs)海绵、蛋白质/多肽翻译模板、基因转录和RNA剪接调节因子。越来越多的证据表明,circRNAs在致癌和癌症进展中起着至关重要的作用。据报道,剪接因子ESRP1介导的circANKS1B促进乳腺癌转移。circANKS1B作为调节三阴性乳腺癌进展的预后因素和调节因子。此外,circRNAs在外泌体中富集并稳定,这为circRNAs作为新型肿瘤生物标记物的开发奠定了基础。已经证明,circRNA是通过非规范的选择性剪接产生的,而RNA结合蛋白(RNA-binding proteins, RBPs)对于circRNA的产生至关重要。然而,迄今为止,circRNAs在TNBC中的潜在功能、生物发生过程和潜在机制仍然不清楚。

为了解决这些科学问题,重庆医科大学陈俊霞课题组于2020年4月7日在Molecular Cancer(IF10.679)期刊发表了题为The circRNA circSEPT9 mediated by E2F1 and EIF4A3 facilitates the carcinogenesis and development of triple-negative breast cancer的研究成果。报道了一个新的由E2F1和EIF4A3介导生成的circRNA circSEPT9,并揭示了circSEPT9通过circSEPT9/miR-637/LIF轴促进三阴性乳腺癌发生和发展的分子机制。暗示了circSEPT9可用作TNBC的潜在预后标志物和治疗靶标。

首先,研究人员通过对4对TNBC组织和癌旁正常组织进行RNA测序以确定TNBC中差异表达的circRNAs,发现了47个上调和307个下调的差异表达circRNAs。在前15个上调的环状RNAs中,研究人员重点关注的是一个新的circRNA circSEPT9,其由SEPT9基因外显子2通过反向剪接产生。并进一步通过Sanger测序、RT-PCR、RNase R消化实验证实了circSEPT9是一种环状RNA。核质分离和FISH实验显示circSEPT9主要存在于TNBC细胞的细胞质中。

随后通过qRT-PCR和原位杂交技术对TNBC中circSEPT9的表达及预后意义进行了评价。发现TNBC细胞和组织中circSEPT9的表达显著增加,并与晚期临床和预后不良呈正相关。

体内外功能实验显示,敲除circSEPT9可以显著抑制TNBC细胞的增殖、迁移和侵袭,诱导TNBC细胞凋亡和自噬,并显著抑制体内肿瘤的生长和转移。而上调circSEPT9则产生相反的作用。

为了探讨E2F1和EIF4A3对circSEPT9生物发生的潜在调控作用,研究人员通过染色质免疫沉淀(ChIP)、萤光素酶报告基因和RNA免疫沉淀(RIP)实验发现E2F1和EIF4A3可能促进circSEPT9的生物发生。

此外,为了验证TNBC中circSEPT9和miR-637之间的关系,研究人员通过荧光原位杂交(FISH)、荧光素酶报告基因和生物素偶联的RNA pull-down实验发现circSEPT9可以通过充当miR-637海绵来调节白血病抑制因子(LIF)的表达,并激活参与TNBC的LIF/Stat3信号通路。

本研究中生物素偶联的RNA pull-down实验涉及的biotinylated-circSEPT9 probe和生物素标记的miRNA mimics由锐博生物提供。

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