Theranostics丨RNA测序+siRNA文库细胞功能筛选快速鉴定乳腺癌化疗耐药基因及其机理

紫杉烷类是三阴性乳腺癌（TNBC）患者的一线化疗药物；但是，化学抗性会降低其有效性。研究人员假设新辅助化疗（NAC）前后肿瘤标本的分子图谱将有助于鉴定与耐药相关的基因。

因此，研究人员通过RNA-seq对来自于8例新辅助化疗TNBC患者的10个样品进行了测序，其中3例病理完全缓解（pCR），5例为非pCR。选择能够预测化疗应答的差异表达基因，并通过小规模siRNA文库进行体外功能筛选。然后，进一步在体内外研究TNBC相关基因的临床和功能意义，并应用生化实验和成像分析来研究其作用机制。

下面就跟随小编一起来看看这篇文章是如何通过高通量测序、以及siRNA文库+细胞功能筛选的方法来鉴定目标分子的吧~~~

（偷偷告诉大家，其实高通量测序与高内涵细胞功能筛选更配哦！该策略能够极大的缩短实验时间，充分解放人力物力，产生的实验结果更加可靠、直观，非常值得一试！）

主要实验结果

• 新辅助化疗下TNBC耐药相关基因的鉴定

首先，研究人员将接受新辅助紫杉醇和卡铂方案治疗的8例TNBC患者依据其反应分为耐药组（n=5）和敏感组（n=3）。接下来，通过RNA-seq对从这8位患者中获得的10个肿瘤样品进行了测序。鉴定了434个常见基因上调，这些基因富集在ECM-受体相互作用、粘着斑、PI3K-Akt信号通路和肌动蛋白细胞骨架调控通路中（图1B）。表明这434个基因可能是对紫杉醇和卡铂联合治疗反应的预测因子，并选择30个top基因进行进一步功能探索，包括SYTL4、BCAM、CTPS2、FKBP9、LAMA3、PDGFRB和ZNF160。

• 体外siRNA文库功能筛选鉴定SYTL4为化疗耐药基因

接下来，研究人员对上述30个基因进行了基于siRNA文库的筛选。通过SI方程计算出所有靶标上的紫杉醇敏化程度呈反S形曲线分布。然后通过平均SI对top基因进行排序发现SYTL4的平均SI最高。qRT-PCR和Western blot验证了SYTL4 siRNA2可使MDA-MB-231细胞中的SYTL4表达降低至基线水平约20％，紫杉醇的IC50降低2.8倍。此外，紫杉醇的IC50值与SYTL4的表达呈正相关。因此，研究人员选择SYTL4作为紫杉醇耐药的主要候选基因进行进一步探索。

• SYTL4在TNBC中的预后价值和临床意义

随后，研究人员评估了SYTL4在TNBC中的预后价值。在KM-plotter公共TNBC队列中，高表达SYTL4的无复发生存率(RFS)更差。SYTL4表达的HR在化疗治疗的TNBC中升高到3.04。相比之下，SYTL4 mRNA在未接受化疗的亚组中预后价值不显著。此外，在FUSCC TNBC队列B中，232例接受辅助化疗的TNBC患者（特别是紫杉醇治疗的患者）高水平的SYTL4 mRNA提示更差的RFS。并且在紫杉醇治疗的患者中，SYTL4的高蛋白水平与较差的无病生存期(DFS)显著相关。表明SYTL4可作为紫杉醇治疗的TNBCs预后不良的指示因子。

• SYTL4在体内外促进TNBC紫杉醇耐药

体外细胞实验显示敲低SYTL4显著提高了TNBC细胞系对紫杉醇的敏感性，但不影响细胞增殖。此外，SYTL4敲低细胞的IC50值也显著更低，挽救SYTL4表达又可提高IC50值。此外，过表达SYTL4更加增加了TNBC细胞系对紫杉醇的耐药性。体内实验显示沉默SYTL4增强了BALB/c裸鼠对紫杉醇的敏感性。表明在体内外改变SYTL4水平可影响TNBC细胞对紫杉醇的敏感性。

• SYTL4与微管相互作用

SYTL4是定位于微管细胞骨架的蛋白，因此，研究人员通过反卷积荧光显微镜观察了SYTL4的分布。结果发现SYTL4与α-微管蛋白共定位。此外，SYTL4-微管蛋白复合物可以在细胞裂解液中免疫共沉淀，表明它们之间存在相互作用。通过结构化照明显微镜(SIM)进行超分辨率成像分析发现SYTL4的linker-C2A结构域（D2）附着于微管表面，SHD结构域（D1）呈自由分布模式，C2B结构域（D3）特异性定位于质膜（PM）附近。co-IP实验也证实了D2与微管相互作用。表明SYTL4通过包含linker-C2A结构域的区域与微管相互作用。

• SYTL4诱导TNBC细胞中的微管不稳定性

紫杉醇诱导的细胞毒性主要依赖于稳定的微管。紫杉醇敏感性的增强可能由微管稳定性的提高引起的。由于SYTL4与微管相互作用，所以研究人员猜测SYTL4是否通过影响微管稳定性而赋予紫杉醇抗药性。结果发现在有/无紫杉醇处理的TNBC细胞中，敲低SYTL4增加了微管蛋白乙酰化水平，并且稳定的微管显著增加。此外，SYTL4的敲低也能稳定微管以抵抗冷处理。

荧光标记微管正端示踪蛋白EB1-ΔC-GFP已成为监测活细胞中微管动态的实用工具。EB1-ΔC以“彗星”的形式结合到微管的正端，从而可以定量微管的生长速率。为了评估SYTL4对微管动力学的影响，研究人员在对照、SYTL4敲低和过表达的MDA-MB-231细胞中监测了超过15,000个EB1轨迹。发现SYTL4敲低后轨迹的增长率降低了。紫杉醇处理后轨迹的生长速率进一步表明，SYTL4敲低显著降低了微管生长速率，而SYTL4过表达可使增长率显著增加。表明SYTL4增加了微管生长过程中的动态不稳定性。

为了确定SYTL4是否可以抵消微管聚合，研究人员通过体外微管聚合实验发现，作为阳性对照，紫杉醇增强了微管聚合。与阴性对照相比，SYTL4抑制体外微管聚合。表明SYTL4增加了微管聚合物的动态不稳定性，从而抵消了紫杉醇诱导的微管聚合效应。

原文链接：https://www.thno.org/v10p10940.htm